摘要:流行病學研究指出,臺灣地區口腔癌發生與嚼檳榔有密切關係。目前,臺灣地區嚼檳榔人口已高達兩百多萬。根據衛生署癌症登記報告指出,口腔癌在臺灣男性十大癌症中死亡率與發生率皆位居第五位,口腔癌年增率也是臺灣地區年增率最高之癌症。可見問題之嚴重。口腔癌的治療包括手術治療合併放射線或是化學治療。往往會造成患者破相或伴隨說話及吞嚥困難。雖然口腔癌治療技術在過去30年有長足進步,但這些治療方法多是非專一性的去除腫瘤,並未完全針對癌細胞的要害加以攻擊,病人之五年存活率並未有明顯改變 (review, Clayman et al.,1996; Kim et al.,2002); 若有復發或轉移, 平均壽命為 6 個月。因此需要一個全新的治療方法來輔助改善整體存活率及生活品質。隨著分子生物學技術的提高和從細胞受體和增殖調控的方向對腫瘤發病機制的進一步認識,開始了針對細胞受體、關鍵基因和調控分子為目標的治療,人們稱之為「標靶治療」 (target therapy)。我們身為牙醫師每天念茲在茲最重要的任務就是要提供病人口腔疾病良好的診斷、治療與預防方式。因此,我們針對口腔癌細胞表面所特有標記做為主要目標,尋找可與癌細胞表面特有的分子做專一結合,促進專一性提升的口腔癌標靶配體。 期待當具辨識能力的標靶配體與抗癌藥物連接後,能將高劑量的化學藥物專一的帶至腫瘤組織。讓癌細胞暴露於局部高劑量的抗癌藥物中,進而被更有效的毒殺。本實驗室第一步成功分離培育出台灣人類頰黏膜鳞狀上皮細胞癌細胞株TW2.6, 它可以在SCID 小鼠上產生 xenograft。因此,我們開始以噬菌體顯示法技術尋找表現於台灣口腔癌癌細胞以及腫瘤血管上的特殊受體。這項研究分成兩部份,第一部份利用in vitro phage display 的方法,尋找可與台灣口腔癌癌細胞專一性結合的標的胜肽。第二部份利用in vivo phage display 的方法,尋找表現於台灣口腔癌腫瘤血管上的特殊受體。研究之初步結果,曾經於去年台北舉行之亞太口腔癌研討會做專題報告。我們首先利用噬菌體顯現 (phage display) 法方法對台灣口腔癌細胞株TW2.6進行篩選,找出8種可以和TW2.6結合之噬菌體株。它們具有與口腔癌細胞株TW2.6專一性結合的能力,同時也可以和在異體移殖的TW2.6 xenograft有專一性的結合。與xenograft結合的能力分別高於普通組織約12.18到222.46倍。控制組的噬菌體株,則不具有與腫瘤組織結合的能力。這些噬菌體株中以C39噬菌體與腫瘤組織專一性結合能力為最強,同時也能和台灣口腔上皮變異細胞株TW1.5做專一性結合。將C39胜肽噬菌體與臨床口腔癌組織檢體及口腔正常組織結合後做免疫染色,發現表現C39標的胜肽的噬菌體可聚集在臨床口腔癌組織檢體,但是口腔正常組織則呈噬菌體染色陰性。有了以上的正面結果以後,我們進一步將將C39胜肽連結Lipo-Dox抗癌藥物(C39- Lipo-Dox)和單一只有此抗癌藥(Lipo-Dox)來進行抗癌療效比較。 期待C39胜肽能將抗癌藥物專一性地帶至腫瘤組織。結果發現以C39 -Lipo-Dox治療的SCID鼠腫瘤成長明顯比Lipo-Dox 組小了 2.5 倍。此外相較於Lipo-Dox治療的SCID鼠體重下降22.6%,C39-Lipo-Dox治療的SCID鼠體重沒有減少,顯示C39- Lipo-Dox所引起的副作用很小。因此C39標的胜肽不但能提高腫瘤治療效果及專一性,也能減輕藥物的毒性, 可提供未來一個口腔癌新穎的治療方式。在第二部份的研究中,我們利用活體淘選 (in vivo biopanning)的方法,尋找表現於台灣口腔癌腫瘤血管上的特殊受體。 藉由五次的篩選過程,發現以TWO5 對於TW2.6 xenograft具有最高的噬菌體效價,其與腫瘤組織的結合能力,相對於腦為616.5倍:相對於心為9.2倍;相對於肺為20.1倍。我們初步以TW05 噬菌體株與人類口腔癌組織檢體incubate, 然後以免疫染色法對人類口腔癌組織檢體做噬菌體株的免疫染色,在腫瘤血管上可以發現陽性染色,但是以 helper噬菌體株(控制組)做相同的免疫染色,口腔癌組織檢體則呈陰性染色。因此初步可認定TW05有與人類口腔癌組織血管專一性結合的能力。為進一步評估TW05胜肽,是否可用於提升化療藥物治療的效能,因此我們測試TW05,與微脂體包覆的抗癌藥Lipo-Dox做結合後是否可提升化療藥物治療的效能。結果發現利用TW05-Lipo-Dox進行治療的小鼠,其TW2.6異體移植腫瘤的體積,比PBS組小了約4.4倍;比Lipo-Dox組小了約1.8倍。利用TW05- Lipo-Dox進行治療的小鼠,其體重變化略同於PBS組;以 Lipo-Dox組進行治療的小鼠,體重則低於治療初期。另外Survival analysis存活分析實驗,雖然發現TW05-Lipo-Dox存活率100%相較於其他兩組(Lipo-Dox組存活率66.67%;PBS組存活率33.33%),可以有效地提升存活率,但由於經費不足,當次使用之老鼠隻數過少,統計差異不夠明顯,有待進一步之研究。以上結果顯示,本實驗室近年來已成功發展癌症之標靶療法,此法採用噬菌體顯現法法,初步找到可與台灣口腔癌xenograft結合之標的胜肽 C39 及腫瘤組織新生血管專一性結合之標的胜肽 TW05,利用這些胜肽與 Lipo-Dox 做結合後,在動物實驗證明有明顯的良好治療效果及減低副作用等優點,展現重要的臨床潛力。我們曾嘗試投稿 Cancer Research 優良期刊, reviewer 雖認為本研究極具創新性,但亦指出許多不足且需要增加及改進之處,希望能進一步補足。除此之外, 由於C39胜肽它對台灣口腔癌細胞株TW2.6及台灣口腔上皮變異細胞株TW1.5 具有專一性的結合能力,比其他美國和日本的口腔癌細胞株要強很多。這個結果顯示,C39胜肽可以和台灣口腔癌細胞特有的分子做專一性的結合。因此分離並分析TW2.6 細胞上與C39 胜肽結合的分子,變得非常的重要。我們學術上可以藉此發現台灣口腔癌特有的分子。實用上可以目標化台灣口腔癌細胞表面上的特殊受器。由於要補足到Cancer Research reviewer 建議程度,所需經費較為龐大,經費不足。同時為了充分發揮 C39 及 TW05胜肽在學術上及臨床上的運用潛能,且能在經費許可情況下做得更完善。 所以提出本三年計劃,充分了解這些胜肽在TW2.6異體移殖口腔癌腫瘤分佈的情形,在台灣口腔癌組織檢體分佈的情形, peptide-Lipo-Dox 抑制TW2.6異體移殖口腔癌腫瘤生長的機轉。這些胜肽在臨床上運用上,除了可以運用這些胜肽攜帶抗癌藥物進行標靶治療外,未來若在胜肽上標誌螢光,放射線元素,或是quantum dot ,可以運用在光學影像的目的上,做為開發台灣口腔癌癌症的偵測與診斷之用。這些成果亦可申請台灣,美國及歐盟專利。 在學術上,擬分離及了解這些胜肽與口腔癌腫瘤結合的分子,並可藉此發現台灣口腔癌細胞表面上的特有分子。為達到此目標, 我們第一年擬 1. 以螢光標示 C39 胜肽,然後以 flow cytometry 分析能結合 C39 胜肽的 TW2.6 細胞的比例。並以螢光顯微鏡觀察 C39 胜肽進入細胞的 kinetics。 2. 以螢光標示的 C39 胜肽注射負有TW2.6 xenograft的SCID小鼠,觀察C39 胜肽在各器官及腫瘤分佈的情形。 3. 以螢光標示或 biotin 標示的 C39 胜肽對至少 50 例的臨床口腔癌組織檢體做染色,觀察C39 胜肽在口腔癌組織檢體的結合能力,並觀察C39 胜肽在臨床口腔癌組織檢體結合的位置和比例。 4. 利用C39-Lipo-Dox治療後, 生長被抑制的xenograft組織切片觀察是否有細胞凋亡發生,了解抑制腫瘤生長作用機轉。 5. 比較用PBS 及Lipo-Dox, C39-Lipo-Dox治療負有TW2.6 xenograft SCID鼠,探究C39- Lipo-Dox治療是否可以抑制腫瘤轉移, 增加存活時間及其作用機轉。本計劃第二年延續第一年計劃擬 1. 構築recombinant C39-glutathione S-transferase (GST) 融合蛋白。 2. 以recombinant C39-GST 融合蛋白分離純化TW2.6 細胞上與C39 胜肽專一性結合的分子。 3. 以MALDI-TOF分析TW2.6 細胞上與C39 胜肽專一性結合的分子(可能是台灣口腔癌特有之分子) 。 4. 選殖與C39 胜肽專一性結合的分子(以下稱 X1 蛋白)至 BL21 大腸菌中表現產生多量X1蛋白。 5. 將X1 蛋白注射兔子,產生X1 蛋白特定抗體。 6. 以螢光標示X1 蛋白抗體,然後以螢光顯微鏡觀察TW2.6 細胞上X1 蛋白的位置及其分佈的情形。 7 將所篩選到的X1 蛋白抗體與C39噬菌體株或C39胜肽去做競爭性抑制, 觀察C39噬菌體株或是C39合成胜肽與TW2.6 細胞結合的能力是否可以明顯被X1 蛋白抗體抑制。 8. 以X1 蛋白抗體對TW2.6 xenograft 及臨床口腔癌組織檢體做染色,觀察X1 蛋白在臨床口腔癌組織檢體結合的位置和比例,並與C39 胜肽比較。未來可以研究C39 胜肽所結合之台灣口腔癌特有之分子(X1 蛋白),它的功能及細胞內的訊號傳遞。本計劃第三年擬 1. 以螢光標示的 TW05 胜肽注射負有TW2.6 xenograft的SCID小鼠,觀察TW05 胜肽在各器官及腫瘤分佈的情形。 2. 以螢光標示或biotin 標示的 TW05 胜肽對至少 50 例的臨床口腔癌組織檢體做染色,觀察TW05 胜肽在口腔癌組織檢體的結合能力,並觀察TW05 胜肽在口腔癌組織檢體結合的情形。 3. 比較PBS, Lipo-Dox, TW05-Lipo-Dox治療的負有TW2.6 xenograft SCID鼠生存分析。 4. 構築recombinant TW05-GST融合蛋白。 5.分離並分析口腔癌組織檢體上與TW05胜肽結合的分子。 由於TW05是利用活體內的噬菌體顯現法找到的能專一性與口腔癌腫瘤血管結合,而不與正常組織結合的胜肽,並沒有適當的體外模式可以利用。必須先以biotin 標示動物器官,均質化,分離出膜蛋白,通過recombinant TW05-GST融合蛋白column, 再以TW05 胜肽析出xenograft上與TW05胜肽結合的少量血管膜蛋白,時間與經費較為高昂。 6. 以MALDI-TOF分析TW2.6 細胞上與口腔癌腫瘤血管專一性結合的分子。本計劃結束後可以了解台灣口腔癌細胞專一性結合之標的胜肽 C39及腫瘤組織新生血管專一性結合之標的胜肽 TW05 在學術上及臨床上的運用潛能。若結果令人滿意的話可以進一步申請臨床試驗。
Abstract: Squamous cell carcinoma (SCC) of the oral cavity is the leading cause of cancer-related deaths in India and South Asian countries. Although treatment of early stage disease (stage I or II) is frequently successful, disease relapses still occur in about 20–30%, particularly local tumor or lymph node recurrence. For patients with advanced disease (stage III or IV), standard therapy is far less successful. Fewer than 30% of them can be cured. Despite recent advances in surgery, radiotherapy and chemotherapy, the overall 5-year survival rate for patients with late stage oral SCC is among the lowest of the major cancers and has not changed during the past two decades. As standard treatments have not cured this disease, continued investigation of new chemotherapeutic agents is thus needed.Recent studies show that in vitro and in vivo phage display is a powerful tool for the discovery of ligands that selectively home to tumor. Using in vitro phage display, we identify several 12-mer peptides specifically binding to xenografts of a Taiwanese oral cancer cell line TW2.6. One selected phage clone, C39 specifically bound to the TW2.6 xenograft and the effects was inhibited by competition with phage-derived peptides. Furthermore, our preliminary studies showed C39-peptide-linked liposomes carried doxorubicin (C39-Lipo-Dox) not only suppressed tumor growth better than Lipo-Dox but also showed no significant body weight change. Using in vivo phage display, we identify several 12-mer peptides specifically binding to vasculature in xenografts of a Taiwanese oral cancer cell line TW2.6. One selected phage clone, TWO-5 specifically bound to the TW2.6 xenograft and the effects was inhibited by competition with phage-derived peptides. Furthermore, our preliminary studies showed TWO-5-peptide-linked liposomes carried doxorubicin (TWO-Lipo-Dox) not only suppressed tumor growth better than Lipo-Dox but also showed no significant body weight change. These results indicate that we successfully isolated two peptides (C39 & TW05) enhanced the efficacy of the drug against oral cancer xenografts in SCID mice and suggest that these peptides have a strong clinical potential for drug delivery guider to treat oral cancer.To take a step further, we propose a three-year project to study the potential usage of oral cancer specific targeting peptides C39 & TW05 on the diagnosis, detection and treatment of oral cancer in more detail. In this study, we will investigate the kinetic and distribution of C39 & TW05 peptides in TW2.6 xenograft model. Furthermore, we will also investigate whether C39-Lipo-Dox/TWO-Lipo-Dox treatment can increase cumulative survival and its mechanism(s). We will also identify the interacting protein for C39/TW05 peptide using GST-pull down and MALDI-TOF analysis.