DC 欄位 | 值 | 語言 |
dc.contributor | 指導教授:鄭益謙 | - |
dc.contributor | 臺灣大學:獸醫學研究所 | zh_TW |
dc.contributor.author | 錢品澄 | zh_TW |
dc.contributor.author | Chien, Pin-Cheng | en |
dc.creator | 錢品澄 | zh_TW |
dc.creator | Chien, Pin-Cheng | en |
dc.date | 2014 | - |
dc.date.accessioned | 2014-12-01T01:00:00Z | - |
dc.date.accessioned | 2018-07-09T06:33:33Z | - |
dc.date.available | 2014-12-01T01:00:00Z | - |
dc.date.available | 2018-07-09T06:33:33Z | - |
dc.date.issued | 2014 | - |
dc.identifier.uri | http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/264504 | - |
dc.description.abstract | 由於 NS1 為非結構蛋白,只有在病毒複製過程才會產生,是判斷動物是否為流感病毒 (influenza virus, IV) 自然感染的重要指標,而目前尚未有 NS1 Ag檢測套組,故本研究利用小鼠免疫 A/chicken/Taiwan/2838V/00 (H6N1/2838) 來源 E. coli 表現之重組 NS1 蛋白,製備抗 NS1 單源抗體 (αNS1 MAb),以間接免疫螢光抗體染色法 (indirect immunofluorescence assay, IFA)、西方墨點法 (western blot, WB)、免疫組織化學染色法 (immunohistochemistry stain, IHC)、真核表現系統 (eukaryotic expression system, EES)、序列比對 (sequence alignment) 等方式進行特性鑑定與分析,進而開發 MAb-based NS1 Ag sandwich ELISA。本研究中 16 種αNS1 MAb 均已經過 H6N1/2838, A/chicken/Taiwan/1209/03 (H5N2/1209) & A/chicken/Miaoli/2904/00 (H6N1/2904) 來源之IFA、WB 與 IHC 等特性鑑定,在真核表現 NS1-F (full length; residues 1-230) 之 IFA 均為陽性;其中有 4 種αNS1 MAb (4M4, 4M6, 4N5, 4R3) 在 NS1-△F (C-terminal deletion; residues 1-207) 之 IFA 呈現陰性,其餘均為陽性。根據 epitope mapping 的分析結果,可將 16 種 αNS1 MAb 分成四大群 (group A, B, C & D),並且主要辨識的位置在 effector domain (residues 74-230),其中 group B 辨識之 epitope 為 C-terminal tail (residues 202-230)。以 αNS1 MAb 分別作為 docking Ab 與 tracer Ab,rNS1 作為抗原進行 sandwich ELISA 條件之優化,挑選表現最佳之組合 (MAb pair, MP);結果顯示,合併 MP-5、MP-9 (4R11 – 4J12/HRP) 與 MP10 (4M2 – 4M2/HRP) 可以偵測 15 種不同 IV 亞型接種 CAM lysate 之 NS1 Ag,故我們相信這三個 MP (MP-5, MP-9 & MP-10) 有潛力應用於檢測不同 IV 亞型之 NS1 Ag。 | zh_TW |
dc.description.abstract | NS1 is an indictor Ag of influenza virus (IV) infection and it’s only produced during IV replication in very early stage of infection. It can be used in determining whether the chicken was infected or not, which also can be applied on early diagnosis of IV infection. Therefore, my study aimed to characterize the anti-NS1 MAb (αNS1 MAb) by indirect ELISA (iELISA), indirect immunofluorescence assay (IFA), western blotting (WB), immunohistochemistry stain (IHC) and mapping the antibody binding site by eukaryotic expression system (EES). Subsequently, to develop a rapid, sensitive and specific diagnostic MAbs-based NS1 Ag sandwich ELISA that might be incorporated with NP and M Ag ELISA kit for detecting the IV infection. The parental hybridoma have been prepared by immunizing Balb/c mice with E. coli expressed recombinant nonstructural protein 1 (rNS1) oringinated from IV isolates of A/chicken/Taiwan/2838V/00 (H6N1/2838). 16 αNS1 MAbs have been characterized by WB, IFA and iELISA with NS1 Ag from several IV isolates such as A/chicken/Miaoli/2904/00 (H6N1/2904), A/chicken/Taiwan/1209/03 (H5N2/1209). Meanwhile, the epitope mapping was studied in EES. Expression of full length rNS1 (residues 1-230) were all positive and 4 αNS1 MAb (4M4, 4M6, 4N5, 4R3) were negative in C-terminal deletion (residues 1-207). Accroding to epitope mapping analysis results, which can divide 16 αNS1 MAb into four groups (A, B, C & D). The predictive epitopes of 16 αNS1 MAb mainly recognize the effector domain (residues 74-230) and group B recognize the C-terminal tail (residues 202-230) of NS1 protein. MAb-based NS1 Ag sandwich ELISA was designed as sixteen MAb individually conjugated with HRP as the tracer Ab paired with each non-conjugated MAb acted as docking Ab respectively to compare the binding ability of those combinations with E. coli expressed rNS1. Current results indicated that MP-5 (4R11 – 4M2/HRP), MP-9 (4R11 – 4J12/HRP) and MP-10 (4M2 – 4M2/HRP) can detect NS1 Ag from 15 subtypes of IV (H1~H15). It is believed the three MP (MP-5, MP-9 & MP-10) we studied have potential to be applied on detecting the IV NS1 Ag. | en |
dc.description.tableofcontents | 口試委員會審定書 i
誌謝 ii
中文摘要 v
Abstract vi
圖目錄 xii
表目錄 xiv
第一章 序言 1
第二章 文獻回顧 2
第一節 歷史背景 2
第二節 流感病毒 (Influenza virus, IV) 之簡介 3
第三節 流感病毒之複製 (replication) 5
第四節 NS1 非結構蛋白之介紹 6
2-4.1 N 端 dsRNA-binding domain (RBD) 8
2-4.2 C 端 effector domain (ED) 9
2-4.3 C-terminal tail (CTT) 與毒力相關之研究 11
第五節 AIV 之診斷方法 12
2-5.1 AIV之抗原偵測 13
2-5.1.1 病毒分離與增殖 (virus isolation and propagation) 13
2-5.1.2 細胞培養 (cell culture) 13
2-5.1.3 血球凝集試驗 (HA test) 14
2-5.1.4 即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (real-time RT-PCR or rRT-PCR) 15
2-5.1.5 免疫組織化學染色法 (IHC) 15
2-5.1.6 商業化套組之AC-ELISA 16
2-5.2 AIV之抗體偵測 17
2-5.2.1 瓊脂膠體免疫擴散法 (AGID) 17
2-5.2.2 血球凝集抑制試驗 (HI test) 18
2-5.2.3 神經胺酸酶抑制試驗 (NI test) 18
2-5.2.4 間接型 ELISA (indirect ELISA, iELISA) 19
2-5.2.5 競爭型或阻斷型 ELISA (competitive/blocking ELISA, cELISA/bELISA) 19
第六節 NS1 標靶之抗病毒治療與疫苗發展 20
第七節 抗 NS1 單源抗體 (αNS1 MAbs) 應用之研究 22
第三章 材料與方法 24
第一節 病毒與細胞培養 24
3-1.1 病毒分離株 (virus isolates) 24
3-1.2 MDCK細胞培養與繼代 24
第二節 抗禽流感病毒非結構蛋白之融合瘤單源抗體製備 25
3-2.1 免疫計劃 (immune program) 25
3-2.2 骨髓瘤細胞培養 (myeloma cell culture) 26
3-2.3 融合瘤製備 (fusion) 26
3-2.4 親代融合瘤篩選 (screening of parental hybridoma) 27
3-2.4.1 間接免疫螢光抗體染色法 (IFA) 27
3-2.4.2 間接酵素聯結免疫吸附試驗 (indirect ELISA) 28
3-2.5 融合瘤細胞單株化 (limiting dilution) 28
3-2.6 腹水製備 (ascites preparation) 29
第三節 NS1抗原之製備與確認 29
3-3.1 重組NS1蛋白 (rNS1) 之製備、純化與定量 29
3-3.1.1 重組 NS1 基因之選殖 29
3-3.1.2 重組 NS1 表現載體 (pET/NS1) 之確認 30
3-3.1.3 重組NS1表現載體之轉型作用 (transformation) 30
3-3.1.4 重組NS1表現載體之質體萃取與定序 31
3-3.1.5 重組NS1蛋白之表現 32
3-3.1.6 重組NS1蛋白之純化與透析 32
3-3.1.7 重組NS1蛋白之定量 33
3-3.1.8 重組NS1蛋白之確認 33
3-3.2 製備 IV 接種之 MDCK cell lysates 35
3-3.3 製備不同 IV 亞型接種之 CAM lysates 35
第四節 抗NS1單源抗體之特性分析與製備 36
3-4.1 單源抗體之亞型分析 (Isotyping) 36
3-4.2 單源抗體之特性分析 37
3-4.2.1 間接免疫螢光抗體染色法 (IFA) 37
3-4.2.2 西方墨點法 (Western blot) 37
3-4.2.3 免疫組織化學染色法 (IHC) 37
3-4.2.4 真核表現系統 (eukaryotic expression system, EES) 38
3-4.3 抗NS1單源抗體之純化與定量 39
3.4.4 抗NS1單源抗體之酵素標示作用 (HRP-conjugation) 40
第五節 開發 MAbs-based NS1 Ag sandwich ELISA 40
3-5.1 測試 16 種 αNS1 MAbs 之特異性與敏感性 40
3-5.2 最佳化 NS1 Ag sandwich ELISA 41
3-5.2.1 最佳化 tracer Ab 與 rNS1 之比例 41
3-5.2.2 最佳化 docking Ab、rNS1 與 tracer Ab 之比例 41
第四章 結果 42
第一節 抗禽流感病毒非結構蛋白之融合瘤單源抗體製備 42
4-1.1 親代融合瘤 (parental hybridoma) 篩選結果 42
第二節 NS1 抗原之製備與確認 42
4-2.1 重組 NS1 表現載體 (pET/NS1) 之確認 42
4-2.2 重組NS1表現載體之轉型作用 (transformation) 43
4-2.3 重組 NS1 蛋白之確認 44
第三節 抗 NS1 單源抗體之特性分析與製備 44
4-3.1 單源抗體之亞型分析 (Isotyping) 44
4-3.2 單源抗體之特性分析 44
4-3.2.1 間接免疫螢光抗體染色法 (IFA) 44
4-3.2.2 西方墨點法 (Western Blot) 45
4-3.2.3 免疫組織化學染色法 (IHC) 46
4-3.2.4 真核表現系統 (eukaryotic expression system, EES) 46
4-3.3 單源抗體之純化與定量結果 46
4-3.4 單源抗體之酵素標示結果 46
第四節 發展 MAbs-based NS1 Ag sandwich ELISA 47
4-4.1 測試 16 種 αNS1 MAbs 之特異性與敏感性 47
4-4.2 最佳化 NS1 Ag sandwich ELISA 47
4-4.3 篩選最佳的 MAbs 組合 (MAb pair, MP) 47
4-4.4 測試 MP-1~MP-8 在H5N2 & H6N1 接種MDCK cell lysate之表現 48
4-4.5 測試 MP-5 在真核表現系統的不同 NS1 抗原之表現 48
4-4.6 測試 MP-5 在15 種不同 IV 亞型接種 CAM lysate 之表現 49
4-4.7 比較MP-5, MP-9 & MP-10 在 H4, H7, H8 & H12 四種亞型之表現 49
4-4.8 比較 16 種 docking Ab 與 tracer Ab (4M2/HRP) 之表現 50
4-4.9 比較不同 MP (MP-1, 2, 3, 5, 10) 在 H8 亞型之表現 50
4-4.10 測試 NS1 Ag 保存時間與 sandwich ELISA (MP-10) 之敏感性 50
4-4.11比較 MP-5, MP-9 & MP-11 在 H5/H6 接種 MDCK cell lysate之表現 51
4-4.12 比較 MP-5, MP-9 & MP-11 在 9 種 IV 亞型 CAM lysate 之表現 51
4-4.13 利用 MP-5 NS1 Ab sandwich bELISA測試HI陽性雞血清中 NS1 抗體 51
第五章 討論 52
參考文獻 95
附錄 128 | zh_TW |
dc.format.extent | 38617525 bytes | - |
dc.format.mimetype | application/pdf | - |
dc.language | zh-TW | - |
dc.rights | 論文公開時間:2019/08/05 | - |
dc.rights | 論文使用權限:同意有償授權(權利金給回饋學校) | - |
dc.subject | 禽流感病毒 | zh_TW |
dc.subject | 非結構蛋白 | zh_TW |
dc.subject | 酵素聯結免疫吸附法 | zh_TW |
dc.title | 抗禽流感病毒非結構蛋白單源抗體之特性分析 | zh_TW |
dc.title | Characterization of Monoclonal Antibodies against Nonstructural Protein 1 (NS1) of Avian Influenza Virus | en |
dc.type | thesis | en |
dc.identifier.uri.fulltext | http://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/264504/1/ntu-103-R01629014-1.pdf | - |
item.cerifentitytype | Publications | - |
item.openairetype | thesis | - |
item.fulltext | with fulltext | - |
item.grantfulltext | open | - |
item.openairecristype | http://purl.org/coar/resource_type/c_46ec | - |
顯示於: | 獸醫學系
|