A craniofacial disorder : implication of crystallin-mutation in cataractogenesis
Date Issued
2004
Date
2004
Author(s)
Wei, Si-En
DOI
zh-TW
Abstract
水晶體蛋白(crystallin)是眼球水晶體內的主要成份，由於晶體蛋白規則性地排列，使水晶體具有透明與屈光的性質。晶體蛋白主要分為α, β, γ三類，其中又以β, γ為主要的結構性蛋白，它們都是由四個Greek-key motifs所組成，若破壞此一構造，可能會造成蛋白質的聚集、沉澱，形成所謂的白內障(cataracts)。因此，本論文是研究晶體蛋白βB1，在缺少1個、2個或3個 Greek key motifs的狀態下，是否會產生白內障的現象。
首先，利用PCR複製不同長度的晶體蛋白βB1 cDNA片段，分別為294 bp (少3 motifs)、437 bp (少2 motifs)和572 bp(少1 motifs)，將這些片段接入pSG5和pIRES-hrGFP表現質體中，以1.3 kb斑馬魚晶體蛋白βB1啟動子片段來啟動表現，將這些結構體以顯微注射方式注入斑馬魚受精卵，觀察水晶體是否有白內障生成。結果顯示不論是注射294 bp、437 bp或572 bp cDNA片段的胚胎，皆無觀察到水晶體有白內障生成的現象，但是卻有綠色螢光專一的表現。另一方面，將含斑馬魚晶體蛋白βB1的572bp cDNA片段的結構體注入小鼠之受精卵中，結果得到三隻轉殖恆定品系的小鼠，其子代水晶體的核心部位皆有綠色螢光的表現，但沒有發現白內障的產生。
為了更進一步確認，缺少一個motif的斑馬魚βB1晶體蛋白，是否存在於恆定品系小鼠的水晶體內，因此製作其多株抗體。經免疫輻射擴散沉澱分析，結果顯示抗血清可以辨識E. coli重組的截切型斑馬魚βB1晶體蛋白以及野生型斑馬魚成魚的βB1晶體蛋白，並與之結合而形成沉澱圈；此外，西方轉漬分析結果顯示，抗血清可辨識到斑馬魚成魚晶體蛋白之二個蛋白質，分子量約為25和21 kDa。而從斑馬魚胚胎的whole-mount immunostaining之結果得知，抗血清所辨識的蛋白質只有專一地表現在水晶體中，因此，推測此二個蛋白質為斑馬魚的βB1晶體蛋白和其他的β晶體蛋白。
另一方面，小鼠的SDS-PAGE分析結果顯示，對照組野生型與轉殖小鼠水晶體的蛋白質分布型態大致相同，且小鼠水晶體內的蛋白質主要分布在15~35 kDa的範圍內，推測其可能是晶體蛋白。在西方轉漬分析方面，結果顯示抗血清可以辨識小鼠的水晶體蛋白質，其大小約為25 kDa，推測其為小鼠的正常βB1晶體蛋白，而截切型的斑馬魚βB1晶體蛋白則沒有被辨識出來，推究其原因，可能是表現量太少或沒有表現。因此，對於缺少一個motif的βB1晶體蛋白是否會產生白內障的問題，還需做進一步的釐清。
Subjects
晶體蛋白
白內障
水晶體
斑馬魚
crystallin
lens
zebrafish
cataract
Type
other
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