Strucutral and Functional Analyses of bHLH Domain of Arabidopsis PIF3

PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR3(PIF3)是植物體內和光訊息傳導有關的重要轉錄因子，透過負調控光訊息傳遞，使植物在黑暗下抑制葉綠素生合成、光合作用及光型態發生等反應。PIF3參與在負調控光訊息傳遞路徑，惟其與上游啟動子的結合機制尚不清楚，本研究透過前人模擬結構及生物物理測定，探究PIF3 DNA結合區與DNA之結合機制。 以單點突變實驗分析各胺基酸位點對二聚體形成的影響，將疏水性胺基酸Leu392、Tyr388、Leu366及Met363個別突變後以膠體過濾層析結果顯示，bHLH會凝集成一巨大分子，失去原有二聚體構型；Met399及Lys362突變後仍能維持原有二聚體狀態。利用螢光電泳遷移實驗(Fluorescein-based electrophoretic mobility shift assay; fEMSA)及等溫滴定微熱量法(Isothermal titration calorimetry; ITC)測量bHLH與G-box DNA(CACGTG)專一性結合能力，將bHLH與DNA鍵結的胺基酸His348、Glu352、Arg355及Arg356，分別突變成Alanine後使得與DNA結合常數上升約1.5至3倍。為測試G-box (CACGTG) 與E-box (CANNTG) 結合差異由R356負責，因此以R356A與四種不同序列之E-box (CANNTG)進行螢光標定電泳遷移實驗，結果四種E-box DNA與R356A的結合常數皆相近，顯示R356作為負責辨認G box核心CG序列的重要功能。最後結構生物學的部分以蛋白質共結晶的方式，篩選出兩種結晶試劑再進行溶液微調，希望透過X-ray繞射分析能解出蛋白質複合體之結構。