Peptide quantification by fluorescamine and its application in protein mass spectrometry
Date Issued
2016
Date
2016
Author(s)
Jian, Cheng-Bang
Abstract
蛋白質譜學為近來興起的分析方法應用於蛋白質體學，其中以散彈式蛋白質體學最廣泛地被應用。散彈式蛋白質體學為一由下而上的途徑，用來分析複雜混合物中的蛋白質組成，先利用蛋白酶將蛋白質水解為胜肽，再利用串聯式質譜法定序樣品中胜肽，最後以序列資料庫鑑定對應蛋白質。傳統上，已知蛋白質含量的樣品於前處理完後會直接進行質譜分析，然而胜肽階段的樣品處理以及質譜分析的不確定性與變異性，如水解效率或是份化過程樣品損失，將直接影響到樣品中的胜肽含量以至於質譜分析的結果。 引入胜肽定量於散彈式蛋白質體學之工作流程中可作為檢查點用以了解樣品前處理過程的變異性，增加分析結果的品質。因此我們研究了兩種一級胺基反應的螢光試劑螢光胺（fluorescamine）以及鄰苯二醛（ortho-phthaldialdehyde；OPA）於胜肽定量上的應用。我們發現相較於OPA，螢光胺對於胜肽有更高的靈敏度。以微孔盤為分析平台，螢光胺對於胜肽檢測極限可低於十微微莫耳以下，相當於十到若干奈克的胰蛋白酶水解胜肽。我們成功地利用螢光胺監測胰蛋白酶的水解速率以及ZipTip除鹽的胜肽回收率，結果顯示尿素的存在會降低樣品回收率。最後我們也利用胜肽定量來探索液相層析－串聯式質譜法質譜（LC-MS/MS）定量分析適當的胜肽裝載量，透過螢光胺定量儀器分析之前樣品水解物中胜肽含量，並觀察樣品胜肽含量對於免標記法以及同重分子標記法（isobaric labeling）的胜肽�蛋白質定量結果之影響，藉此來評估適當的樣品裝載量。我們建議螢光胺作為胜肽定量的工具，應用於定量散彈式蛋白質體學的胜肽樣品的品質管制。
Subjects
Fluorescamine
peptide quantification
shotgun proteomics
sample preparation
quantitative proteomics
Type
thesis
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Name
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