Titanium dioxide sol-gel coated column for the capillary electrochromatographic separation of peptides and proteins
Date Issued
2004
Date
2004
Author(s)
Hsieh, Yi-Ling
DOI
zh-TW
Abstract
本研究以二氧化鈦溶膠凝膠塗佈熔融矽毛細管內璧，作為開管式毛細管電層析之靜相。首先使用titanium(IV) isopropoxide作為溶膠凝膠前驅物，在pH 1.5條件下將其快速水解縮合成二氧化鈦奈米粒子。實驗改變溫度(30 - 70℃)及攪拌時間，並以吸收度(λonset)來監測反應進行狀態，最佳條件為冰浴1小時後以50℃攪拌7小時。產物為穩定且透明的膠體溶液，由TEM推測粒徑約為10 nm。合成之膠體溶液再經由真空濃縮控制二氧化鈦濃度為40 %，利用氮氣裝置導入經由NaOH(1 M)活化之毛細管內，將管柱在150 ℃反應24小時，使溶膠之鈦醇基和毛細管表面的矽醇基進行縮合反應。所製備的二氧化鈦塗佈管柱經過電滲透流測試，發現以Tris及甲酸作為緩衝溶液時可測得管壁等電點為pH 5，pH低於此值則產生逆向的電滲流。而在glutamic acid與磷酸緩衝溶液中，因帶負電的動相分子會與管壁錯合形成一遮蔽層，在pH 2以上均為正向的電滲透流。換言之，不同的動相組成將導致不同的電滲流行為。因此本研究以三種血管收縮素Angiotensin I、Angiotensin II、[Sar1, Thr8]-Angiotensin II作為模型分子，探討二氧化鈦管柱之分離機制。實驗發現二氧化鈦塗佈次數的增加對分離並無影響，但表面因等電點(pH 5)較二氧化矽高(pH 2)，對分析物靜電吸附情形減少許多。由研究發現，其主要機制為與鈦金屬錯合，流析快慢為AgST > AgI > AgII。本研究並選擇不同的緩衝溶液包括Tris、甲酸、glutamic acid及磷酸，經由pH值(pH 2-10)以及緩衝溶液濃度(5-50 mM)等系列測試，發現動相會與分析物競爭管壁上的中心鈦原子而將分析物從靜相中交換出來，使層析峰的解析度大為提高且分離較為快速，錯合力大小依序為磷酸 > glu > Tris∼甲酸。實驗最佳化條件為40 mM、pH 6之磷酸緩衝溶液，平均理論板數3.1×104 m-1，RSD值為1.21-1.51% (N=5)。本研究進一步將此管柱應用於白蛋白serum albumin、ovalbumin及運鐵蛋白apo-transferrin、conalbumin之分析。藉由金屬錯合等作用力，可在接近生理條件下將結構與電泳度均相似的分析物解析開，流析順序為ConA > apoTf > OVA > BSA，並大致推得五種OVA醣蛋白的微異型結構。最佳條件為40 mM，pH 8之磷酸緩衝溶液，實驗RSD值為2.88-5.79% (N=3)。而在40 mM，pH 8之磷酸緩衝溶液條件下，可由雞蛋蛋白中同時分離出三種酸性及鹼性蛋白質，流析順序為lysozyme > ConA > OVA。並定量出OVA濃度約為0.26 g/mL。
Subjects
溶膠凝膠
蛋白質
二氧化鈦
胜肽
毛細管電層析
Titanium dioxide
sol-gel
capillary electrochroma
Type
thesis
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