人類眼輪匝肌因老化產生的肌肉纖維及肌凝重鏈蛋白組成變化

1.1 研究背景與目的
眼輪匝肌 (Orbicularis oculi muscle) 在眼睛四周的解剖構造中佔了關鍵地位，並在這區域的老化過程中扮演了重要角色。而眼睛四周的年輕化 (periorbital rejuvenation) 一直是整形外科領域中極有興趣的課題，我們相信藉由了解人類眼輪匝肌老化相關的變化，將對改善現有的年輕化技術或開發新的年輕化方法建立深入研究的基礎。然而文獻中並沒有任何相關的研究報告，因為眼輪匝肌的採樣不僅困難且有傷及眼球的危險。事實上在眼皮整型手術中所切除的軟組織中即含有小部分的眼輪匝肌，所以我們以接受上眼皮整型手術 (upper blepharoplasty)的病人為對象，取得不同年紀病人的眼輪匝肌樣本。
我們以這些眼輪匝肌樣本為研究材料，研究的第一部分探討眼輪匝肌因老化產生的組織型態學 (histomorphometry)變化，主要為三種肌肉纖維 (I, IIA, IIB)的組成及截面積之改變。研究的第二部分則探討各亞型的肌凝重鏈蛋白 (myosin heavy chain, MHC)在眼輪匝肌中的組成比例，藉評估不同年紀人類的眼輪匝肌中三種亞型 (I, IIA, IIX)的相對含量，進而了解眼輪匝肌因老化產生的分子生物學相關變化。

1.2 研究材料與方法
此研究的第一部分是以組織型態學的方法，評估人類眼輪匝肌因老化產生的各型肌肉纖維組成變化。眼輪匝肌的肌肉樣本自手術中取得後立刻在液態氮中做冷凍包埋並於-80℃的冷凍庫中保存，實驗時先作冷凍切片，對肌纖維中的腺三磷酸酵素(adenosine triphosphatase, ATPase)作組織化學染色。我們在顯微鏡下觀察這些切片，並選擇具橫斷切面的適當區域照相，相片掃描入電腦後以影像處理軟體分析即可得到該區域中各肌肉纖維的數目及其所佔的面積，並可進一步算出不同肌肉纖維間的比例及其平均直徑等組織型態學變數。
此研究第二部分的設計是以分子生物學的方法客觀評估各型的肌凝重鏈蛋白在人類眼輪匝肌中的組成比例，進而了解其因老化產生的相關變化。因為肌凝重鏈蛋白是構成肌纖維的主要蛋白質，且不同亞型的肌凝重鏈蛋白存在於不同型的肌肉纖維中，並決定其收縮的速度，故肌肉中各亞型的肌凝重鏈蛋白所佔比例決定了某肌肉之收縮特性，並可間接代表不同肌肉纖維間的比例。眼輪匝肌的肌肉樣本自上眼皮整型手術中取得後立刻在液態氮中做冷凍包埋並於-80℃的冷凍庫中保存，實驗時先做冷凍切片，接著將切片溶於特殊緩衝液中，再以SDS-PAGE電泳分離出不同亞型的肌凝重鏈蛋白。我們將銀染色後的膠片掃描入電腦，以影像處理軟體分析膠片上各條紋的密度，即可進一步算出不同亞型的肌凝重鏈蛋白間的相對含量。
在統計分析方面，我們控制性別此項干擾因子後，將各組織型態學變數及不同亞型的肌凝重鏈蛋白所佔比例與年齡作線性回歸分析。此外，我們選出年輕與老年兩組病人，年輕組指的是小於50歲病人，老年組指的是70歲以上的病人。我們以Wilxoson ranksum test來分析這兩組其組織型態學變數及不同亞型的肌凝重鏈蛋白間比例是否有所差異。我們設定的顯著p值為<0.05。

1.3 研究結果
本實驗第一部分為組織型態學的研究，共收集到35位病人的眼輪匝肌樣本適合作分析，年齡分布為21至82歲。平均第 I型肌纖維所佔比例為12.5%，IIA型肌纖維所佔比例為37.1%，IIB型肌纖維所佔比例為50.4%。
我們控制性別此項干擾因子後，將各組織型態學變數與年齡作線性回歸分析。我們所分析的組織型態學變數包括各類型肌纖維所占數量的百分比，肌纖維的平均直徑及截面積，及各類型肌纖維所占面積的百分比。線性回歸分析的結果並無任何變數具有統計上的顯著意義。此外我們將小於50歲的11位病人與大於70歲的11位病人分組比較，發現老年組 (大於70歲病人)中IIA型肌纖維的平均截面積為 710 ± 47 µm2，相較於年輕組 (小於50歲病人)的IIA型肌纖維平均截面積800 ± 96 µm2，其差異在統計學上則是有意義的。此外，老年組的眼輪匝肌平均肌肉纖維截面積 (mean fiber area)為 674 ± 51 µm2，較年輕組的平均肌纖維面積726 ± 47 µm2顯著為小，其餘組織型態學變數之差異則不具統計上的顯著意義。老年組與年輕組間所計算出三種的肌纖維比例分布並無顯著差異，三種肌纖維所佔比例由多至少次序為 IIB > IIA > I。三種肌纖維所占的相對肌纖維面積比例分布在兩組間亦無顯著差異，相對肌纖維面積比例由多至少次序同樣為 IIB > IIA > I 。
第二部分為評估各亞型的肌凝重鏈蛋白在人類眼輪匝肌中的組成比例，總共收集到58位病人之眼輪匝肌樣本，病人的年齡範圍自21歲到91歲。平均MHC I的相對含量為 21.8 ± 4.7 %，MHC IIA的相對含量為 37.4 ± 5.5 %， MHC IIB的相對含量為 40.8 ± 5.7 %。控制性別此項干擾因子後，我們將不同亞型的肌凝重鏈蛋白所佔比例與年齡作線性回歸分析。我們觀察到隨年齡的增長，眼輪匝肌中IIA型肌凝重鏈蛋白所佔比例顯著地減少，第I及IIX型肌凝重鏈蛋白所佔比例則不具統計上的顯著變化。如同實驗的第一部分，我們將接受上眼皮整型手術的病人依年齡分組，小於50歲的17位病人屬年輕組，大於70歲的20位病人屬老年組，兩者相互比較，但各亞型肌凝重鏈蛋白所佔比例在兩組間之差異不具統計上的顯著意義。

1.4 結論
在第一部分組織型態學的研究中，我們觀察到老年人相較於年輕人，其眼輪匝肌中平均肌肉纖維截面積及IIA纖維截面積顯著減少，但各型肌肉纖維組成比例並不隨著年齡而有所變化。在第二部分評估各亞型肌凝重鏈蛋白的組成比例的研究中，我們發現年齡的增加與眼輪匝肌中IIA型肌凝重鏈蛋白所佔比例減少是有相關的。
綜合我們的結果，與我們收集到的文獻相較，顯示出人類眼輪匝肌老化現象並不完全相同於四肢或咀嚼肌肉，在肌肉纖維的萎縮形態與肌凝重鏈蛋白亞型組成比例的改變上呈現其獨特的老化模式。藉由了解人類眼輪匝肌之老化模式，未來我們即可客觀評估一些抗老化療法對其老化過程的影響，並對開發新的年輕化方法建立深入研究的基礎。