https://scholars.lib.ntu.edu.tw/handle/123456789/145952
標題: | 以基因剔除技術研究cullin-4B的功能 III | 作者: | 林淑華 | 關鍵字: | cullin 4B;ubiquitin 連接酶;組織特異性基因剔除鼠;Cre-LoxP | 公開日期: | 2005 | 出版社: | 臺北市:國立臺灣大學醫學院醫學檢驗暨生物技術學系 | 摘要: | Cullin 蛋白藉由組合成不同的泛素連接酶,以調節細胞內各種重要的蛋白質,而此 一調節是經由泛素-蛋白降解體路徑來完成。迄今cullin 家族已有七個基因被發現,而我 們的主要研究對象- Cul4B 是否參與調控與發育相關的蛋白仍待釐清。Cul4B 在許多種 組織都有表現,包括腦部、睪丸、卵巢、攝護腺、結腸、脾臟、肝臟及周邊血球細胞甚 至整個胚胎都可偵測到。為了解Cul4B 的功能,我們同時藉由建造動物模型及細胞培養 的方式來回答此一問題。首先希望建立組織特異性Cul4B 基因剔除小鼠而能在不同的器 官研究此蛋白質在活體內的功能,我們已建構好Cul4B 條件式基因剔除載體,並用以轉 染107 小鼠胚胎幹細胞。由抗生素篩選得到的264 個細胞株中,經由南方墨點法的分析, 共得到8 個標的成功的細胞株。取出囊胚期卵子,注射幹細胞後,植入代孕母鼠,共產 出5 隻嵌合鼠。嵌合鼠與黑色B6 母鼠互配後,得到了栗色毛的子代,證明其遺傳來源 為胚胎幹細胞,且為Cul4B 基因標定的異型合子。由此一異型合子交配而得到同型合子 後,再與特定在肝或生殖細胞表現Cre 的轉殖鼠互配,便可得到組織特異性Cul4B 基因 剔除鼠,以作為進一步研究Cul4B 功能的材料。 同時,我們也應用生化學的方法來研究Cul4B 的功能。首先,建立會表現myc 標 記的Cul4B 蛋白之細胞株,並以共同免疫沈澱的方式將細胞內與Cul4B 有交互作用的 蛋白沈澱下來;經由電泳分離後,將特定位置的蛋白切下,以質譜分析鑑別。經由此一 程序,發現TIP120A 及DDB1 與Cul4B 有交互作用;其中,TIP120A 已知會以負調控 的方式調節多種泛素連接酶,而先前的研究則發現DDB1 是Cul4A 的轉接蛋白,並且 參與細胞週期的調節。這暗示Cul4B 在正常生理狀況下可能會以相似於Cul4A 的作用 方式進行蛋白質降解之調節。 本實驗室未來的目標是分析Cul4B 基因剔除鼠的表現特徵,以及繼續用共同免疫沈 澱法找尋與Cul4B 有交互作用的蛋白,以建立由Cul4B 組成的泛素連接酶調控體內蛋 白表現的模式。 |
URI: | http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/27800 | 其他識別: | 933112B002039 | Rights: | 國立臺灣大學醫學院醫學檢驗暨生物技術學系 |
顯示於: | 醫學檢驗暨生物技術學系 |
檔案 | 描述 | 大小 | 格式 | |
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