DAPK與ERK之交互作用在促進細胞死亡訊息傳遞上 的調控分析

Abstract

死亡相關蛋白激酶（Death-associated protein kinase, DAPK）是一個具有死亡區塊（death doamin）的絲胺酸╱酪胺酸激酶（serine/threonine kinase），同時發現其參與干擾素－γ（interferon-γ）所引發的細胞凋亡反應（apoptosis）。後續的研究指出在多種刺激所誘發的細胞凋亡中均有DAPK參與，同時DAPK的死亡區塊能正向地調控細胞凋亡前期的反應。為了釐清那些分子藉由與DAPK的死亡區塊作用來造成細胞凋亡前期的反應，我們利用DAPK的死亡區塊為餌，以酵母菌雙雜交系統（yeast two-hybrid）來進行篩選。篩選結果發現：胞外訊息調控激酶1及2（extracellular signal-regulated kinases 1and 2, ERK 1及ERK 2）可能會和DAPK的死亡區塊作用。我們證明：無論是在試管內或是活體內反應，DAPK可以專一性地與ERK 1及ERK 2相互作用，同時這作用是藉由座落於DAPK死亡區塊內的高保留性ERK嵌合序列（consensus ERK docking sequence）所調控。更進一步地發現在DAPK的絲胺酸735（S735）位置能被ERK所磷酸化，這意味著DAPK是ERK的受質。此外，利用各式的試管內或活體內反應分析，我們發現ERK磷酸化DAPK主要是在S375的位置，然後更重要的一點是，此磷酸化的結果會藉由降低催化反應的Km值來達到增加DAPK激酸酶反應的活性。再深入地探討ERK如何調控DAPK，本論文亦證明一個反向的調控機制：即DAPK所造成ERK進入細胞核及細胞核內訊息傳導的抑制。所以，這些發現構築了一個DAPK與ERK相互調控的機轉。因為ERK造成的細胞核內訊息傳導會參與部份抑制細胞凋亡的功能（anti-apoptotic function），所以我們提出一個假說：DAPK與ERK的交互作用會構成一個正向回饋反應（a positive feedback loop），最終將促進DAPK所造成的細胞凋亡。事實上，我們的實驗數據顯示在過量表現DAPK的細胞中，ERK的活性可以促進DAPK所導致的細胞凋亡。除此之外，破壞既有的ERK與DAPK相互作用（藉由過量表現DAPK死亡區塊的方式），會降低因Fas誘發同時DAPK參與的細胞凋亡反應。最後，在生理上的細胞凋亡系統中，我們發現正向調節ERK-DAPK複合物（ERK-DAPK complex）的生成及促進其後續的雙向調控，和細胞凋亡均有高度的相關性。再者，在此系統中無論是抑制ERK的活性或是降低DAPK的表現都能有效地抑制細胞凋亡。所以提出了生理證據證明ERK-DAPK複合體能促進細胞凋亡的進行。總結而論，這些結果顯示DAPK和ERK之間的雙向訊息傳遞經由DAPK死亡區塊來促使細胞凋亡。

Death-associated protein kinase (DAPK) is a death domain (DD)-containing serine/threonine kinase identified by its participation in the interferon-