The Conformation of the Protein Subunits of ATP Synthase Studied by Single Molecule Detection Methods
Date Issued
2006
Date
2006
Author(s)
Huang, Yu-Wei
DOI
zh-TW
Abstract
隨著生化科技時代的來臨，研究生物體的結構以及運動方式，而解開許多生物遺傳及特性的奧秘，成為生物化學的研究主流。本篇論文利用單分子偵測技術，探討如何解開生物體的運動模式。單分子偵測由於可以讓生物分子處於活性狀態時，同步觀察其動態行為，近幾年來，成為探索許多生物機制的利器。
本篇論文為架構一台物鏡式全反射/共聚焦螢光顯微系統，以及呈現單分子的觀察。論文的順序是以簡介單分子偵測技術，光學零件原理，實驗架設，未來應用為主軸，單分子偵測技術以目前實驗室的儀器可以做到共聚焦以及全反射兩種方式，光學元件部份將把兩年中實驗過的各種儀器介紹其原理並稍做比較，使讀者能夠理解為什麼現在使用這些東西，實驗架設則是列舉稜鏡式全反射、物鏡式全反射、物鏡式共聚焦等三種實驗方式，並一一比較其優缺點，最後則以未來應用結尾，希望在不久的將來能夠實現對生物分子的測量。
如何選擇適當的雷射光源，成功取得全反射位置，以及架構兩台光子計數器同時對同一位置進行收光，是本篇論文的重點。全反射螢光顯微系統架設的困難處在於：（一）觀測光源極為微弱且尺寸已在繞射極限的單分子，（二）如何產生成功的全反射光源於顯微鏡物鏡觀測點，（三）如何製作單分子觀測所需的樣品，（四）降低背景雜訊值以及提高實際訊號值。為解決光源極為弱小的問題，本實驗採用雪崩式光二極體（APD）及高解析度的電荷耦合元件（CCD）來偵測，為了適當取得繞射極限的單分子訊號數值，則利用內徑相近的光纖來進行收光。而為了成功產生全反射光源，則必須讓雷射光的光束半徑在一公厘以下，且在整個實驗中不能有大太的光線擴束現象發生。製作單分子觀測樣品也是一門學問，如何選擇在繞射極限大小的螢光分子，並進行適當的調光手續，是實驗中最繁瑣的一部分。最後，為提高訊號/雜訊比，則是這個實驗最重要的部份，必須從光源，光學元件，收訊系統，樣品置備等全方位考量，才能達到適切的答案。
此篇論文所研究的光學系統是傳承自民國九十三年七月鄭淑雅學姊的畢業論文研究，而進行修改，雖然整體架構已經完全不同，但是沒有學姐之前努力留下的紀錄以及經驗，今天這套光學系統不會有這麼好的數值呈現。修改一個光學顯微鏡的步驟，比想像中的繁瑣多了。尤其是一個極精密的單分子顯微鏡，其中一個步驟的閃失，都有可能造成訊號的重大失誤。碩士班兩年，從完全不懂顯微鏡開始摸索，成功看到單分子，到後來搬動實驗室，重新架設，又重新設計，置換許多零件，唯一的目的只是希望這台儀器能夠提高最高的效能，而做出精確的實驗數據。
很感激這中間許多人的幫助，尤其是我的指導教授蘇志明老師，每當我有了困難時，老師總是不厭其煩和我討論，幫助我解決架設上以及理論上的困難。沒有老師的慷慨幫助，也許我會犯了許多錯誤而做出完全偏差的架構。還要感謝陳美芳學姐，在之前的學姊畢業後，美芳學姐替我保留許多實驗數據以及指導我樣品的製作，傳承了實驗的經驗。以及之後即將接手實驗的余明龍學弟，許多實驗室的雜務都由他經手，希望他之後的研究能夠順利完成。也謝謝實驗室的每位成員：陳育穎學長、吳俊毅助教、吳尚臻學弟、郭雲飛學弟，但是無論在搬動實驗室、架設無塵室、重組顯微鏡裝置等困難工作到日常地搬運二次水及記帳問題，如果沒有大家的幫忙，不會有今天的成果。
Subjects
蘇志明
單分子
共聚焦
全反射
TIRF
Confocal
Type
thesis
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Name
ntu-95-R93223084-1.pdf
Size
23.31 KB
Format
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