雙叉桿菌具轉半乳糖作用β-半乳醣及其應用於半乳糖寡醣合成之研究(3/3)

Abstract

本研究首先以三角錐瓶系統，比較雙叉 桿菌包括Bifidobacterium longum BCRC 15708、B. longum BCRC 14634、B. longum B6、B. infantis BCRC 14633、B. breve BCRC 11846 、B. bifidum BCRC 14615 、B. adolescentis BCRC 146087 菌株-半乳糖苷酶 (-galactosidase)之產生，而發現B. longum BCRC 15708 所產生之-半乳糖苷酶活性及 比活性最高，進一步探討不同碳源(lactose、 glucose 及galactose)及氮源(yeast extract、 peptone、(NH4)2SO4、tryptone、gelatin、casein 及beef extract)對B. longum BCRC 15708 生產 -半乳糖苷酶之影響。結果顯示，乳糖及酵 母抽出物分別為其最適之碳源及氮源，當以 最適培養液組成(4% lactose 、3.5% yeast extract、0.3% K2HPO4、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O 和0.03% L-cysteine)及最適培 養條件(初始培養液pH 值為6.5 及培養溫度 為37℃) 發酵培養16 小時後，可得最高之- 半乳糖苷酶活性，約為18.6 U/ml。 來自B. longum BCRC 15708 之-半乳糖 苷酶經Q Fast Flow 陰離子交換樹酯層析及 Superose 6 膠體過濾層析純化後，可得純化倍 數15.7 倍及酵素比活性168.6 U/mg 之-半乳 糖苷酶，以Native PAGE 分析發現其分子量 為357 kDa。當以OPNG 作為反應基質時， 酵素反應之最適作用溫度及pH 值分別為50 ℃及7.0，最大反應速率(Vmax)及反應速率常 數(Km)則分別為70.67 U/mg 及0.85 mM。鈉 離子及鉀離子可促進酵素之活性，當其添加 濃度為100 mM 時，相較於未添加者而言， 約可分別提高-半乳糖苷酶活性達12 及10 倍；1 mM 之鐵離子、鈷離子、銅離子、鋅離 子等則會造成-半乳糖苷酶活性被嚴重抑制 之結果。半乳糖、乳糖及果糖等亦均會抑制- 半乳糖苷酶活性，其中當以OPNG 為反應基 質時，乳糖之抑制作用可能為競爭型抑制之 一種。 利用密閉5 公升發酵槽培養B. longum BCRC 15708 進行-半乳糖苷酶之生產顯 示，最適之初始乳糖及酵母抽出物添加濃度 分別為4 及3.5%，而最適之初始接種菌量、 培養溫度、培養液pH 值及攪拌速率則分別 為20% (v/v)、37℃、6.5 及100 rpm。並於最 適培養條件下，發酵培養10 小時後，可得最 高-半乳糖苷酶活性及轉半乳糖活性，分別 為36.7 及0.49 U/ml。 最後，研究發現本試驗菌株於初始乳糖 濃度為40%，反應液pH 值為6.8 及反應溫度 為45℃下，當乳糖之轉化率為57.8%時，可 產生最大之半乳寡醣量，相較於反應液中之 總糖量而言為30.1%，生成之半乳寡醣聚合 度(DP)為3 及4，其中又以3 糖為主要之半乳 寡醣；隨著反應液中初始乳糖添加濃度之增 加(5-40%)，愈有利於酵素進行半乳寡醣之生 成；β-半乳糖苷酶進行轉半乳糖反應之最適 pH 值及溫度分別為6.8 及45℃，當降低或提 高反應液之pH 值(4.8；7.8-8.8)或溫度(25-35 ℃；55-65 ℃)時，均不利於半乳寡醣之產生， 其中溫度之影響較pH 值之影響為顯著。此 外，於反應液中額外添加葡萄糖或半乳糖， 亦會抑制β-半乳糖苷酶之轉半乳糖反應。