江文章臺灣大學：食品科技研究所李季螢Lee, Chi-YingChi-YingLee2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/56281動脈粥狀硬化除了是一慢性發炎疾病外，亦是一不能以單一病因來探討之疾病，早期研究認為動脈粥狀硬化和血管表面脂質的堆積有密切關係，而近年來越來越多的研究指出氧化壓力和低密度脂蛋白的氧化也是主要的病因之一。因此本研究擬從氧化傷害之角度出發，利用試管試驗及細胞模式探討荷葉乙醇萃取物及其四種溶劑（正己烷、乙酸乙酯、正丁醇及水）區分層對動脈粥狀硬化早期發展的影響，並期望能得知其有效區分層及可能活性物質。 實驗結果顯示，荷葉乙醇萃取物之乙酸乙酯區分層具有最佳的清除活性氧屬自由基能力，且能有效的抑制銅離子誘導人體離體低密度脂蛋白氧化，顯示乙酸乙酯區分層可能具有降低氧化壓力以防止動脈粥狀硬化形成之能力；同時乙酸乙酯區分層亦可促進巨噬細胞吞噬氧化低密度脂蛋白，且能減緩巨噬細胞衍生的泡沫細胞及氧化低密度脂蛋白所誘發之發炎反應，顯示乙酸乙酯區分層可能對動脈粥狀硬化早期發展具影響能力，並藉此達到延緩動脈粥狀硬化發展之效用。 第二部分則是針對乙酸乙酯區分層進行膠體層析後得1 ~ 11個次區分層進行試驗，其中第8、9、10層於各試驗所表現出來的能力皆較乙酸乙酯區分層來的好，於是將此三層進行HPLC比對後，發現其中可能的有效活性化合物為quercetin、p-coumaric acid、syringic acid或其他類黃酮類物質，因此推測荷葉中具延緩動脈粥狀硬化發展之能力可能有一部分來自於類黃酮及酚酸類物質，另一部分可能來自於未定性出的其他類黃酮物質或生物鹼。Atherosclerosis is a chronic inflammation disease that cannot be defined as a single disease entity. In early study, it shows atherosclerosis has great relationship with lipid accumulated in surface of vessel but recently research has indicated oxidative stress and oxidation of LDL(low density lipoprotein)being major causes, too. In this research, we use the ethanolic extract from lotus leaf(LLE)and its four partitions(LLEP1、LLEP2、LLEP3、LLEP4)as raw materials to study their effects on the early stages of atherosclerosis by in vitro test and cell model. The results showed that partition of ethyl acetate from LLE(LLEP2)had the greatest scavenging ability of reactive oxygen species and inhibition of LDL oxidation. LLEP2 could also promote macrophage ability to endocyte oxLDL and to decrease the inflammation which was induced by oxLDL and macrophage-derived foam cells. Consequently, it seems LLEP2 can affect the early stages to retard the formation of atherosclerosis. In the next part assay, we used LLEP2 as materials to do gel filtration and got 11 subfractions(1 ~ 11). According the results we found subfraction of 8, 9, 10 had better ability than that of LLEP2. The results of HPLC showed the possible active compounds in the subfraction of 8, 9, 10 were quercetin、p-coumaric acid、syringic acid and other flavonoids. The ability of lotus leaf to retard the formation of atherosclerosis could be from flavonoids and some unknown compounds.目 錄 頁數 中文摘要----------------------------------------------------------------------------------------Ⅰ ABSTRACT-------------------------------------------------------------------------------------Ⅱ目錄----------------------------------------------------------------------------------------------Ⅲ 圖次----------------------------------------------------------------------------------------------Ⅶ 表次----------------------------------------------------------------------------------------------Ⅸ 壹、 前言------------------------------------------------------------------------------------------1 貳、 文獻整理------------------------------------------------------------------------------------2 一、 心血管疾病（cardiovascular disease, CAD）與動脈粥狀硬化（atherosclerosis）------------------------------------------------------------------2 二、 動脈粥狀硬化------------------------------------------------------------------------2 (一)動脈粥狀硬化形成過程-------------------------------------------------------3 (二)動脈粥狀硬化致病機轉-------------------------------------------------------4 1. 氧化修飾假說（oxidative-modification hypothesis）-低密度脂蛋 白氧化修飾（LDL oxidative modification）--------------------------4 2. 內皮弁鄍Ⅴ捸]endothelial dysfunction）-損傷反應假說（response-to-injury hypothesis）-----------------------------------------5 三、 自由基與氧化壓力------------------------------------------------------------------5 (一)氧化壓力與動脈粥狀硬化----------------------------------------------------6 (二)活性氧屬（reactive oxygen species, ROS）-------------------------------7 1. 超氧陰離子自由基( Superoxide anion radical, O2•-)-----------------7 2. 過氧化氫 ( Hydrogen peroxide, H2O2) ---------------------------------8 3. 羥基自由基 (Hydroxyl radical, •OH) --------------------------------8 4. 過氧化脂質（lipid hydroperoxide, LOOH）--------------------------9 (三)活性氧屬和動脈粥狀硬化----------------------------------------------------9 四、 抗氧化防禦系統-------------------------------------------------------------------10 (一)體內防禦系統-----------------------------------------------------------------10 (二)抗氧化物質--------------------------------------------------------------------11 五、 脂蛋白-------------------------------------------------------------------------------13 (一)低密度脂蛋白-----------------------------------------------------------------13 (二)低密度脂蛋白之氧化修飾--------------------------------------------------14 (三)氧化低密度脂蛋白和動脈粥狀硬化之關係-----------------------------15 六、 細胞組成與動脈粥狀硬化-------------------------------------------------------15 (一)巨噬細胞（macrophage）--------------------------------------------------16 (二)泡沫細胞（foam cell）之形成---------------------------------------------17 (三)泡沫細胞壞死與動脈粥狀硬化--------------------------------------------17 七、 細胞激素（cytokine）------------------------------------------------------------17 八、 荷葉----------------------------------------------------------------------------------18 (一)植物蓮介紹--------------------------------------------------------------------18 (二)生理活性-----------------------------------------------------------------------20 1. 降血脂----------------------------------------------------------------------20 2. 抗氧化----------------------------------------------------------------------21 參、 研究目的----------------------------------------------------------------------------------22 肆、 實驗設計----------------------------------------------------------------------------------23 伍、 材料與方法-------------------------------------------------------------------------------25 一、 實驗材料----------------------------------------------------------------------------25 (一)荷葉-----------------------------------------------------------------------------25 (二)細胞株--------------------------------------------------------------------------25 (三)人體血液-----------------------------------------------------------------------25 (四)試驗藥品-----------------------------------------------------------------------25 1. 製備樣品用----------------------------------------------------------------25 2. 試管試驗用----------------------------------------------------------------26 3. 細胞試驗用----------------------------------------------------------------27 4. HPLC用--------------------------------------------------------------------28 (五)細胞培養用品-----------------------------------------------------------------28 二、 儀器設備----------------------------------------------------------------------------28 三、 分析方法----------------------------------------------------------------------------29 (一)樣品製備-----------------------------------------------------------------------29 (二)清除活性氧屬自由基--------------------------------------------------------31 (三)抑制銅離子誘導人體離體低密度脂蛋白氧化--------------------------34 (四)細胞毒性與存活率測試（MTT）-----------------------------------------37 (五)巨噬細胞形成泡沫細胞之檢測--------------------------------------------38 (六)巨噬細胞及其衍生泡沫細胞分泌促發炎激素測定--------------------39 (七)矽膠管柱層析-----------------------------------------------------------------41 (八)荷葉中具特殊生理活性的成分分析-高效能液相層析儀（high performance liquid chromatograph, HPLC）----------------------------42 (九)統計分析-----------------------------------------------------------------------42 陸、 實驗結果----------------------------------------------------------------------------------43 一、 荷葉乙醇萃取物及其四種溶劑區分層之各活性能力測試----------------43 (一)清除活性氧屬自由基--------------------------------------------------------43 (二)抑制銅離子誘導人體離體低密度脂蛋白氧化--------------------------45 (三)J774A.1毒性與存活率測試（MTT）------------------------------------45 (四)巨噬細胞形成泡沫細胞之檢測--------------------------------------------46 (五)巨噬細胞及其衍生泡沫細胞分泌促發炎激素測定--------------------47 二、 荷葉乙醇萃取物之乙酸乙酯層有效次區分層之分離及其活性分析----48 (一)膠體層析-----------------------------------------------------------------------48 (二)清除活性氧屬自由基--------------------------------------------------------49 (三)抑制銅離子誘導人體離體低密度脂蛋白氧化--------------------------50 (四)巨噬細胞形成泡沫細胞之檢測--------------------------------------------51 (五)巨噬細胞及其衍生泡沫細胞分泌促發炎激素測定--------------------52 (六)荷葉中具特殊生理活性的成分分析--------------------------------------53 柒、 綜合討論----------------------------------------------------------------------------------55 一、 荷葉乙醇萃取物及其四種溶劑區分層之各活性能力測試----------------55 (一)清除活性氧屬自由基--------------------------------------------------------55 (二)抑制銅離子誘導人體離體LDL氧化-------------------------------------57 (三)巨噬細胞形成泡沫細胞之檢測--------------------------------------------58 (四)巨噬細胞和其衍生泡沫細胞分泌促發炎激素測定--------------------59 (五)荷葉乙醇萃取物乙酸乙酯區分層（LLEP2）和動脈粥狀硬化發展之關係------------------------------------------------------------------------------60 二、 荷葉乙醇萃取物之乙酸乙酯層有效次區分層之分離及其活性分析----60 捌、 總結----------------------------------------------------------------------------------------63 玖、 參考文獻----------------------------------------------------------------------------------971418270 bytesapplication/pdfen-US動脈粥狀硬化氧化壓力荷葉lotus leafatherosclerosisoxidative stressthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/56281/1/ntu-93-R91641019-1.pdf