吳蕙芬臺灣大學：農藝學研究所黃吉心Huang, Chi-HsinChi-HsinHuang2007-11-282018-07-112007-11-282018-07-112006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/59161大腸桿菌的ClpY/HslU為一種AAA 蛋白質（ATPase associated with various cellular activities），是具有ATPase活性的伴隨蛋白（chaperone）；ClpQ/HslV則是一種具胜肽酶（peptidase）活性的蛋白質。ClpY能與ClpQ形成具有蛋白酶活性的的多元體ClpYQ，其中ClpY扮演辨識基質並藉著消耗能量將基質解開送入ClpQ的角色；再經由ClpQ胜肽酶分解基質；前人發現ClpYQ與真核生物中的26S proteasome是具有同源性的。在結構上ClpY是以六元體環狀的形式，與兩個同為環狀的六元體ClpQ所構成的十二元體結合來作用。 在近年來的研究中指出，從已有的結晶結構來預測ClpYQ的作用區域可能在ClpY的羧基端以及ClpQ六元環之間形成的空間。而在2002年亦有實驗發現，若將ClpY最後十個胺基酸逐漸去除時，ClpYQ蛋白酶會失去其分解胜肽的能力；並且也會逐漸失去形成ClpYQ多元體的能力；更進一步甚至影響ClpY其本身形成六元環的能力；導致ClpY無法與胜肽酶 ClpQ結合而進行作用，因此失去ClpYQ蛋白酶的活性。 本實驗從已有的結晶結構預測可能之ClpQ與ClpY之交互作用點：ClpQ E61及K28及各自對應點ClpY R440及L443。並使用分子生物技術的方法，分別在胺基酸位置E61及K28建構全長為175個胺基酸之ClpQ點突變株，先使用RcsA及SulA相關系統來分析建構之突變株是否能與ClpY或是前人建構之ClpY突變株形成ClpYQ蛋白酶的活性，再分別使用酵母菌雙雜交系統 （Yeast two-hybrid system）觀察ClpY與ClpQ之間的作用力，以期望了解ClpY 羧基端結合與活化ClpQ功能的關係。發現ClpY之羧基端就如同一把鑰匙，插入ClpQ與相鄰ClpQ間產生的之孔隙，並開啟 ClpQ 的活性。藉著 ClpQ 結構改變的作用力可以幫助其緊密結合。其ClpY羧基端本身於長度、電荷以及其胺基酸構形上皆有適當的要求，且ClpQ孔隙由大量正電荷胺基酸所構成。ATP-dependent proteolysis plays an essential role in controlling the levels of key regulatory proteins and in the elimination of abnormal polypeptides. These tasks are carried out by architecturally related ATP-dependent proteases such as the 26S proteasome in eukaryotes and two component protease, the ClpAP, ClpXP, and ClpYQ (HslUV) in archea and eubacteria. The clpYQ/hslVU operon in Escherichia coli encodes two heat shock proteins, the HslV/ClpQ peptidase and HslU/ClpY ATPase. Both ClpY and ClpQ self-assemble into a hexameric rings. Until now, two substrates RcsA and SulA of another ATP-dependent protease Lon, and RpoH, can be recognized by ClpY. In the clpYQ complex, the ClpY and ClpQ central pores are aligned, and the proteolytic active sites are sequestered in an internal chamber of ClpQ, with access to this chamber restricted to small axial pore. The roles of translocate peptides from ClpY to ClpQ and how interaction of ClpY and ClpQ to initiate ClpQ activity are not clear. In the research of Seong et al, an insertion of ClpY C-terminal tails into pockets at the ClpQ-ClpQ interface in the ATP-bound state might cause an opening of the central pore of ClpQ peptidase for an access of unfolded polypeptide substrates into the ClpQ proteolytic chamber. The ClpY C-terminal tail is essential for its interaction with ClpQ and for an activation of the peptidase. With ClpY molecule, the last 7 amino acids sequence of ClpY is highly conserved, and the lacking of the last four amino acids, ClpY leads to ClpYQ inactive. In this study, from ClpYQ crystal structure, R440 and L443 in ClpY C-terminal are opposited to E61 and K28 in ClpQ. Moreover, ClpQ point mutants in the position E61, K28 were constructed. And these positions were substituted with other 19 Amino acids. Subsequently, two methods were used to funtionally assay the activation between ClpQ mutants and ClpY as well as ClpY C-terminal mutants in E.coli. The yeast two-hybrid system was used to analyze oligomerlization of mutants between ClpQ-ClpY and ClpQ-ClpQ. The aim of this study is to find the significance of E61 and K28 in ClpQ, and a relationship between an interaction and an activation of ClpY and ClpQ protease.中文摘要 7 Abstract 8 壹、前言 9 一、蛋白酶簡介 9 二、熱休克蛋白酶HslUV（ClpYQ）簡介 10 三、雙次元體ClpYQ 11 四、大腸桿菌ClpYQ蛋白酶之結構分析 12 五、大腸桿菌ClpYQ蛋白酶之基質 13 六、大腸桿菌ClpY羧基端與ClpQ之關係 15 七、研究動機及目的 17 貳、材料與方法 19 一、研究材料 19 1、實驗菌株及質體 19 （1）ClpYQ於細胞內之活性表現系統（Activation assay） 19 （2）酵母菌雙雜交系統（Interaction assay） 19 2、藥品及試劑 20 （1）相關酵素 20 （2）培養基 20 （3）實驗相關核酸引子 21 3、分析軟體 21 4、結構資料 21 二、實驗方法 21 1、質體製備與轉殖 21 （1）質體製備 22 Mini-preparation of plasmid DNA from bacteria（小量製備） 22 Midi-preparation of plasmid DNA from bacteria（大量製備） 22 （2）質體轉殖 22 限制酶(restriction enzyme )反應 22 DNA瓊脂膠體(agarose gel )電泳 22 DNA瓊脂膠體(agarose gel )電泳回收DNA 22 接合反應(DNA ligation ) 22 2、勝任細胞（competent cell）製備 23 MC1068（用於大量複製一般質體） 23 KC8（用於電穿孔法electroporation transformation） 23 3、轉形作用（transformation） 24 （1）E. coli transformation 24 Heat shock transformation 24 Electroporation transformation 24 TSS-Transformation（用於AC3112菌株之轉形） 25 4、ClpQ點突變基因之質體建構 26 （1）二次聚合酶連鎖反應（PCR, Polymerase chain reaction） 26 （2）選殖基因之質體製備（Cloning Technology） 28 pGilda（用於Yeast菌株之轉形） 28 pB42AD（用於Yeast菌株之轉形） 28 pBAD33（用於AC3112菌株之轉形） 28 5、ClpYQ於細胞內表現之活性測試（Activation assay） 29 （1）β-galactosidase活性測試 29 （2）MMS（Methyl methansulfonate）之抗性分析 30 6、酵母菌雙雜交系統報導基因之表現測試（Interaction assay） 31 （1）lacZ 表現：酵母菌β-galactosidase活性測試 31 （2）lacZ 表現：酵母菌X-gal測試 32 （3）leu2 表現：酵母菌生長測試 33 7、程式分析 33 3D結構之預測與分析 33 參、實驗結果 34 一、前人建構之ClpY羧基端之突變蛋白分析與整理 34 二、分析建構之ClpQ E61點突變蛋白 34 1、ClpQ E61突變蛋白之活性分析 35 （1）從β-galactosidase活性分析ClpQ E61突變蛋白與ClpY作用分 解RcsA的能力 35 （2）以MMS生長測試分析ClpQ E61突變蛋白與ClpY作用分解 SulA的能力 36 2、用Yeast two-hybrid分析建構的ClpQ E61突變蛋白與ClpY之間的交互作用力 36 3、用Yeast two-hybrid分析建構的ClpQ E61突變蛋白本身形成六元 體的能力 37 三、分析建構之ClpQ E61C點突變蛋白與前人建構之ClpY羧基端R440 之突變蛋白之間的活性與交互作用力 38 1、ClpQ E61C突變蛋白與ClpY羧基端R440突變蛋白之活性分析 38 2、用Yeast two-hybrid系統分析ClpQ E61C突變蛋白與ClpY羧基端R440突變蛋白之間的交互作用力 39 四、以建構之ClpQ E61C點突變蛋白與ClpY羧基端L443之突變蛋白進 一步分析活性與交互作用之關係 39 1、ClpQ E61C突變蛋白與ClpY羧基端L443突變蛋白之活性分析 39 2、用Yeast two-hybrid系統分析ClpQ E61C突變蛋白與ClpY羧基端 L443突變蛋白之間的交互作用力 40 五、分析建構之ClpQ K28點突變蛋白 41 1、ClpQ K28突變蛋白之活性分析 41 2、用Yeast two-hybrid分析建構的ClpQ K28突變蛋白與ClpY之間 的交互作用力 41 3、用Yeast two-hybrid分析建構的ClpQ K28突變株本身形成六元體 的能力 42 六、分析建構之ClpQ K28R點突變蛋白與前人建構之ClpY羧基端L443 之突變蛋白之間的活性表現 42 七、以結構軟體分析ClpQ蛋白之正電荷胺基酸分布位置 43 肆、討論 45 一、胺基酸E61在ClpQ蛋白質中扮演的意義 45 二、分析ClpQ E61與ClpY R440之間的關係 45 三、胺基酸K28在ClpQ蛋白質中扮演的意義 46 四、分析ClpQ K28與ClpY L443之間的關係 47 五、正電荷胺基酸在ClpYQ蛋白酶中的重要性 47 六、整理分析ClpQ與ClpY之間活性與交互作用的關係與重要性 48 七、結論 50 伍、參考文獻 52 陸、表 64 柒、圖 731318322 bytesapplication/pdfen-US蛋白酶熱休克大腸桿菌交互作用ClpYClpQproteaseEscherichia colichaperoneHslUHslVATP-dependentinteractionthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/59161/1/ntu-95-R93623022-1.pdf