陳義雄臺灣大學：生化科學研究所李金美Lee, Chin-MeiChin-MeiLee2007-11-262018-07-062007-11-262018-07-062004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/52763大白鼠儲精囊分泌主要蛋白依分子量依序為RSVS I~V，本實驗室曾將RSVS III以質譜儀定序的結果顯示此蛋白為大白鼠RpSv-1 mRNA所轉譯的產物。 由免疫組織化學法的檢視，顯示RSVS III是由儲精囊表皮細胞分泌累積在腔道。 RSVS III 蛋白可以和RSVS I及 RSVS II受到transglutaminase催化而形成高分子的共價聚合物，顯示RSVS III是交配栓的組成蛋白之一。 RpSv-1(RSVS III?基因的結構包含啟動子區序列 1771個鹼基對，3個長度分別為92、1482及327個鹼基對的exon和2個長度分別為230及89個鹼基對的intron。其中，exon1轉譯為signal peptide，exon2轉譯為完整的蛋白質序列，而exon3是3’-untranslated region，此基因結構特色符合「快速演化的轉麩胺醯胺酸基質(Rapid Evolving Substrate of Transglutaminase)」(REST)基因家族。 RSVS IIIㄟ穧]位於大白鼠染色體3q42，在此染色體區域中，發現另一個和RpSv-1(RSVS III?基因序列99.9%相似的RSVS IIIβ基因，以北方墨點法及RT-PCR確認這兩個基因都專一地表現在儲精囊中，其mRNA表現皆受到雄性素的刺激，然而兩基因的表現量不同。儲精囊表現的REST基因在人類染色體20q13、小白鼠染色體2H3及大白鼠染色體3q42，其中後二者有相似的基因體排列，我以這些基因的序列分析及演化樹的建構探討其分子演化的關係。Rat seminal vesicle secretion protein contains five well-defined major components designated RSVS I-V in decreasing order of molecular weight. RSVS I-III were covalent cross-linked to form high molecular complexes by transglutaminase. RSVS III was confirmed to be derived from RpSV-1 mRNA. RSVS III was immunolocalized in the luminal epithelium of seminal vesicle and the copulatory plug. The genomic structure of RpSv-1(RSVS III?was analyzed to establish a 5’-flanking region of 1771 bp, three exons of 92, 1482 and 327 bp, and two introns of 230 and 89 bp. The transcription unit is organized with the first exon encoding a signal peptide, and the second exon encoding a protein in its entirety, whereas the third encompasses a 3’-untranslated region, that shares common features with the arrangement of transcription units of the rapid evolving substrate of tansglutaminase (REST) gene family. The RSVS III?gene was mapped to chromosome 3q42 locus. We found another paralog, RSVS IIIβ gene, which shares 99.9% nucleotide sequence identity to RSVS III?in the same locus. Northern blotting and RT-PCR were performed to demonstrate the exclusive expression of this duplicated pair in seminal vesicle with a ratio of RSVS III?mRNA to RSVS IIIβ mRNA ≒ 2.0. The mRNA expression of RSVS III? RSVS IIIβ were stimulated by testosterone. The genes in human chromosome 20q13, mice chromosome 2H3 and rat chromosome 3q42 were identified to have the arrangement of their transcription units similar to a REST gene. The molecular evolution of these REST genes is discussed.目次 1 中文摘要 3 英文摘要 4 縮寫表 5 第一章 概論 1.1 哺乳類雄性生殖系統構造及發育 6 1.1.1哺乳類雄性生殖系統構造 6 1.1.2哺乳類雄性生殖系統的發育 7 1.1.3儲精囊在各物種的差異性 7 1.2 儲精囊分泌蛋白及其弁?8 1.2.1調節精子生理弁鄋瑰x精囊分泌蛋白 9 1.2.2調節免疫反應的儲精囊分泌蛋白 9 1.2.3參與精液凝結(coagulation)的儲精囊蛋白 10 1.3 精液的凝結與交配栓的形成 10 1.3.1交配栓的弁?10 1.3.2交配栓的形成 10 1.4 REST基因家族 11 1.5 研究背景 12 1.5.1本論文研究緣起 12 1.5.2本論文研究重點 13 第二章 材料與方法 實驗動物 14 實驗方法 15 2.1 聚合酶連鎖反應 15 2.2 洋菜膠體電泳 16 2.3 DNA片段溶離 17 2.4 限制酶反應 17 2.5 DNA 接合反應 18 2.6 質體轉型 (Transformation) 19 2.7 小量質體抽取 20 2.8 RpSV-1基因組片段的製備 21 2.9 Total RNA的萃取 23 2.10 RNA品質的檢定 24 2.11 快速放大cDNA之5’或3’端 (Rapid Amplification of cDNA Ends) 25 2.12 北方點墨法(Northern blotting) 27 2.13 逆轉錄-聚合酶連鎖反應 (RT-PCR) 及 基因表現量比較 31 2.14 分子演化樹的建構 33 2.15 SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳 34 2.16 Coomassie Blue G-250染色 35 2.17 重組蛋白表現載體之建構 35 2.18 重組蛋白之誘導表現與純化 37 2.19 製備RSVS III 抗體 39 2.20 蛋白質定量 39 2.21 西方墨點法 40 2.22 ELISA 42 2.23 H&E染色及免疫組織化學法 43 2.24 儲精囊蛋白交聯反應 46 2.25 蛋白質溶液之透析及濃縮 47 第三章 實驗結果 3.1 大白鼠儲精囊蛋白RSVS III是RpSV-1 mRNA的產物 48 3.2 RSVS III蛋白在儲精囊表皮細胞表現 48 3.3 RSVS III參與交配栓的形成 49 3.4 大白鼠RpSV-1 (RSVS III?基因序列及基因結構分析 49 3.5 發現大白鼠RpSv-1(RSVS IIIa)相似基因-RSVS IIIβ 49 3.6 RSVS IIIㄓ?RSVS IIIβ在儲精囊中表現量的差異 50 3.7 RSVS IIIㄓ垟SVS IIIβ在儲精囊專一地表現 51 3.8 RSVS IIIㄓ垟SVS IIIβ的基因表現受到雄性素刺激 51 3.9 RSVS IIIㄐBRSVS IIIβ及其他REST家族基因的分子演化分析 52 圖 54 第四章 結論與與未來展望 82 4.1 大白鼠儲精囊分泌蛋白RSVS III與交配栓的形成 82 4.2 RSVS IIIㄓ垟SVS IIIβ是REST基因的成員 82 4.3 RSVS IIIㄓ垟SVS IIIβ基因的演化 83 4.4 RSVS IIIㄓ垟SVS IIIβ基因表現受到雄性素刺激 83 4.5 REST基因在人類、大白鼠、小白鼠在染色體上的位置及演化 84 4.6 未來研究的方向 85 圖表 86 參考文獻 88 附錄 952090270 bytesapplication/pdfen-US基因演化轉麩胺醯胺酸酶儲精囊交配栓copulatory plugtransglutaminaseseminal vesicleREST gene evolutionotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/52763/1/ntu-93-R91242022-1.pdf