劉春櫻臺灣大學:化學研究所李佳欣LEE, CHIA-HSINCHIA-HSINLEE2010-06-302018-07-102010-06-302018-07-102009U0001-2307200909420400http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/187499本研究將二氧化鋯以溶膠凝膠方式塗佈於熔融矽毛細管內壁作為毛細管電層析靜相，首先以氯氧化鋯zirconium (IV) oxychloride溶於乙醇與水形成澄清透明的溶膠凝膠溶液，導入毛細管內，與管壁的矽氧基進行縮合反應。將所製備完成的管柱，以磷酸緩衝溶液在不同的pH值進行電滲流測試，由於磷酸會與二氧化鋯錯合，發現即使在低於二氧化鋯的pI值 (pH 5-6) 時，管柱電滲流仍為正向而非理論上的逆向。本研究將其應用於分離含鐵的血紅蛋白 (Hb) 及肌紅帶白 (Mb) ，經由磷酸緩衝溶液的pH值與濃度等改變，皆獲得流析順序為Mb > Hb，符合文獻中Hb對二氧化鋯奈米粒子的binding constant較Mb大。並於20 mM、pH 9硼酸緩衝溶液中發現血紅蛋白存在α、β subunit兩個波峰，加入20 % (v/v) MeOH作為有機修飾劑增加疏水性，可提升分離效率。本研究進一步將其應用於分離磷酸化蛋白質，如卵白蛋白 (OVA) 、α-酪蛋白 (α-casein) 及牛血清蛋白 (BSA)， 與含鐵蛋白質，如伴蛋白 (ConA)及運鐵蛋白 (Tf) 之分析。研究發現磷酸化蛋白質α-casein、BSA隨著磷酸緩衝溶液pH值的改變，其滯留時間改變較ConA及Tf明顯，且緩衝溶液濃度增加，動相會與分析物競爭，使得層析峰的分離較為快速及波峰變窄。此研究證明二氧化鋯奈米表面的特殊錯合行為會影響毛細管電層析的分離機制，尤其與含有磷酸官能基的分析物進行配位基交換，可達到更有效的分離。本研究進一步發現此管柱具有高度優異性分離異構物，在40 mM、pH 9之硼酸緩衝溶液條件下，可得到14種以上OVA醣蛋白異構物，並以此條件進行雞蛋、鴨蛋等真實樣品中醣蛋白之分析，發現雞蛋、鴨蛋的OVA構形有明顯差異，但其流析順序均為ConA > OVA，由標準添加法得知紅色雞蛋的ConA濃度為0.72 mM。A ZrO2 nanoparticles(NPs) coated column was prepared through the sol-gel reaction of zirconium(IV) oxychloride with silanol groups of the fused-silica capillary. The condensation reaction was carried out at 350 oC for 8 h. Electroosmotic flow (EOF) measurements and SEM image were used for the characterization of the ZrO2 on the inner wall of capillary. Below the pI value (pH 5-6), cathodic EOF was elucidated that the phosphate buffer adsorb tightly on the zirconia surface resulting in a negative charge surface. In this work, iron-binding-, phosphorylated- and glyco-protein were selected as the model compounds. For the optimization, the effects of pH, concentration and buffer type as well as the organic modifier on the separation were studied. The results of iron-binding proteins show that the retention time is Mb > Hb. It is corresponding to the binding constants of ZrO2 NPs. α-, and β-subunit of Hb could be separated in borate buffer (20 mM, pH 9.0), MeOH (20 %, v/v). A greater affinity of α-casein and BSA toward the stationary phase was indicated by the comparison with that of ConA and Tf as pH increase. Interestingly, 14 peaks of glycoisoforms of OVA were observed under borate buffer (40 mM, pH 9.0). The established method was also applied to the determination of ConA and OVA in egg-white of chicken and duck egg. The concentration of ConA in chicken egg-white is 0.72 mM.第一章 緒論 1一節 二氧化鋯 1-1 二氧化鋯之物理化學性質 1-1.1 基本結構 1-1.2 二氧化鋯表面特性 2-1.3 包覆劑對表面的影響 3-1.4 二氧化鋯與磷酸根表面吸附作用 4-2溶膠凝膠法製備二氧化鋯溶液 5-2.1 反應機制 5-2.2 反應參數 6-3 二氧化鋯應用 7二節 分析物簡介 13-1 含鐵蛋白質 13-1.1 肌紅蛋白 (myoglobin) 13-1.2血紅蛋白 (hemoglobin) 14-1.3卵伴蛋白（conalbumin） 15-1.4 運鐵蛋白 (transferrin) 16-2 磷酸化蛋白質 16-2.1 α-酪蛋白 (α-casien) 16-2.2 牛血清蛋白 (bovine serum albumin) 17-3 醣蛋白 17白蛋白（ovalbumin） 17-4 蛋白質分析 22三節 毛細管電層析簡介 25-1 毛細管電層析原理 25-1.1文獻回顧 25-1.2 毛細管電層析種類 26-2 開管式毛細管電層析於蛋白質之分析應用 29-2.1 表面吸附 29-2.2 共價鍵結 31四節 研究動機 36二章 實驗部份 37一節 實驗儀器 37.1 毛細管電泳儀器裝置 37.2 其它實驗操作儀器 38二節 實驗試藥 40-1 管柱製備 40-2 緩衝溶液 40-3 分析樣品 41三節 二氧化鋯管柱製備與性質鑑定 42-1 毛細管前處理 42-2 二氧化鋯管柱之製備 42-3 二氧化鋯奈米粒子性質鑑定 43-3.1紫外光吸收光譜鑑定 43-3.2掃描式電子顯微鏡鑑定 43四節 毛細管電層析實驗操作 44-1 藥品配置 44-1.1 緩衝溶液 44-1.2 電滲流標記物之配置 44-1.3 分析樣品 44-2 電滲流的測定 46-3 毛細管電層析應用於生物分子之分離 46三章 結果與討論 47一節 二氧化鋯奈米粒子之製備 47二節 二氧化鋯奈米粒子管柱之製備與鑑定 47-1 二氧化鋯塗佈管柱之製備 47-1.1 毛細管前處理 47-1.2 二氧化鋯奈米粒子管柱製備 48-2 管柱電滲透流及表面性質測試 49-2.1 反應時間對管柱電滲流之影響 49-2.2 動相濃度影響 53-3 掃描式電子顯微鏡鑑定 54三節 毛細管電層析之分析應用 56-1 含鐵蛋白質之分離 58-1.1 動相pH值影響 60-1.3 動相種類濃度影響 65-1.4 有機修飾劑之影響 70-2 磷酸蛋白與含鐵蛋白之分離 74-3 醣蛋白之分離 79-4 真實樣品之分離 84四章 結論 90考文獻 9214071355 bytesapplication/pdfen-US二氧化鋯奈米粒子毛細管電層析蛋白質zirconia nanoparticleCECproteinthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/187499/1/ntu-98-R96223112-1.pdf