何國榮臺灣大學：化學研究所蔡竺芸2007-11-262018-07-102007-11-262018-07-102005http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/51918我們以簡單的設備建立毛細液相層析電灑法串聯質譜儀，成功地鑑定大白鼠第二型肺泡細胞特有胞器-層質體 (lamellar bodies) 之組成蛋白質，有助於未來臨床上對呼吸窘迫症病患的處理與治療。有鑑於層析方法過於耗時，本研究第二部分為開發簡單且可拋棄式的灑探針，將消化並淨化後的胜肽直接送入串聯質譜儀進行分析，可達到快速鑑定蛋白質及無樣品殘留之問題；以肌紅蛋白 (Myoglobin) 的胰蛋白酶 (trypsin) 消化胜肽為樣品，蛋白質身分鑑定的極限可至2.5 fmol，具有使用方便及低樣品消耗的優點。第三部分我們以濃縮為主訴求，希望能開發簡單、實用且能線上淨化的方法，所開發之線上淨化微電灑串聯質譜儀，可大幅提高濃縮倍率及減少分析時間，實際應用於層質體的蛋白質體，得到高可信度的蛋白質鑑定結果。We set up an on-line micro capillary reversed phase liquid chromatography interfaced to a tandem mass spectrometry (μLC-MS/MS) for protein identification. Proteins from lamellar bodies which were separated by two-dimensional gel electrophoresis were identified by μLC-MS/MS. However, the current technique is rather time consuming. To reduce the analysis time, we developed a disposable device that combined on-line clean up and infusion unseparated proteolytic peptides into an ESI tandem MS. It was demonstrated that several proteins of lamellar bodies could be successfully identified by using this on-line clean up method. Compared to μLC-MS/MS, this method could identify proteins rapidly and without the problem of cross-contamination although the peptide sequence coverage was slightly lower.第一章 序論 ……………………………………………………………………… 1 1-1 蛋白質身分之鑑定 ………………………………………………… 3 1-2 二維膠體電泳 (2-Dimentional Polyacrylamide Gel Electrophoresis) …… 5 1-3 電灑法串聯質譜儀 (ESI Tandem MS) …………………………… 7 1-3-1 電灑法 (electrospray ionization；ESI) ……………………………… 7 1-3-2 離子阱質譜儀 ……………………………………………………… 9 第二章 實驗 …………………………………………………………………… 18 2-1 毛細液相層析系統 ……………………………………………………… 18 2-1-1 毛細管柱的製作 …………………………………………………… 18 2-1-2 流速與分流器 (Splitter) 的設計 ………………………………… 20 2-1-3 動相與梯度系統 …………………………………………………… 20 2-2 拋棄式微電灑探針 (Microelectrospray Tip) …………………………… 22 2-2-1 微電灑探針的製作 ………………………………………………… 22 2-2-2 取樣方式 …………………………………………………………… 22 2-2-3 導電方式 …………………………………………………………… 23 2-3 線上淨化 (Clean-up) 微電灑 (Microelectrospray) 偵測 …………… 24 2-3-1 淨化毛細管柱 (Clean-up column) ……………………………… 24 2-3-2 微電灑探針的製作 ………………………………………………… 25 2-4 電灑法串聯質譜儀 ……………………………………………………… 26 2-5 資料庫搜尋 ……………………………………………………………… 27 2-6 層質體 (Lamellar Bodies) 樣品製備 ………………………………… 28 2-6-1 蛋白質的定量 ……………………………………………………… 28 2-6-2 樣品去鹽處理 ……………………………………………………… 29 2-6-3 二維膠體電泳 (Two-Dimensional Electrophoresis；2-DE) ………… 30 2-6-4 膠體染色 (Staining) ………………………………………………… 32 2-6-5 膠體內水解 (In gel digestion) ……………………………………… 33 2-6-6 ZipTipC18淨化 (Clean-up) ………………………………………… 35 第三章 結果與討論 …………………………………………………………… 51 3-1 毛細液相層析電灑法串聯質譜儀 ……………………………………… 51 3-1-1 毛細液相層析系統設計…………………………………………… 53 3-1-2 毛細液相層析串聯質譜儀系統測試 ……………………………… 54 3-1-3 層質體 (Lamellar Bodies) 蛋白質身分鑑定 …………………… 54 3-2 拋棄式微電灑探針串聯質譜儀 ………………………………………… 56 3-2-1 微電灑探針訊號強度與穩定性 …………………………………… 57 3-2-2 拋棄式微電灑探針串聯質譜儀於蛋白質身分鑑定 ……………… 57 3-3 線上淨化 (Clean-up) 微電灑 (Microelectrospray) 偵測 …………… 59 3-3-1 線上淨化 (Clean-up) 微電灑 (Microelectrospray) 方法可行性 … 59 3-3-2 蛋白質鑑定之測試 ………………………………………………… 60 3-3-3 線上淨化 (Clean-up) 微電灑探針與拋棄式微電灑探針之比較 …………………………………………………………………… 61 3-3-4 線上淨化微電灑串聯質譜儀於層質體之蛋白質身分鑑定 ……… 61 第四章 結論 …………………………………………………………………… 83 參考文獻 ………………………………………………………………………… 842205449 bytesapplication/pdfen-US質譜蛋白質mass spectrometryprotein identificationthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/51918/1/ntu-94-R92223058-1.pdf