陳昭岑臺灣大學：化學研究所廖元正Liao, Yuan-ChengYuan-ChengLiao2007-11-262018-07-102007-11-262018-07-102004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/51710摘要 本論文主要是在開發醣受體 (蛋白質)感測分子，分別利用香豆素單體分子及寡聚合物、金及二氧化矽奈米粒子來當感測分子架構中的訊號讀出單元，再將醣殘基連結在這些架構上，利用醣殘基與蛋白質的專一結合性。一旦使感測器分子與分析蛋白質結合，可藉由所設計的信號讀出，達到辨識偵測效果。此感測分子系統因為本身具有信號讀出單元，所以欲分析的蛋白質不必先作標識即可達到偵測目的，對於微量樣品的蛋白質分析，提供了另一方便快速的方法，亦可將所發展的醣受體感測分子用到蛋白質體學醣受體種類研究。 我們設計合成具有norbornene-香豆素-醣殘基三種組成單元的感測分子單體，藉由開環歧化聚合反應 (ROMP) 有效率建構出具有多價性 (multivalence) 的醣-香豆素寡聚合物。在聚合過程中引入冠醚烯類衍生物進行開環共聚合反應，以增加寡聚合物的水溶性及降低醣殘基的立體擁擠性；寡聚合物具有多價醣殘基及烷醚親水的骨幹，所以有較佳的水溶性，同時可增強與蛋白質的結合力。此感測分子利用醣殘基與含有多結合部位的凝集素專一結合，造成寡聚合物間的交錯聚集 (aggregation) 及沈澱，同時紫外光-可見光吸收值大幅下降，達到簡易方便的偵測的目的。 關於金奈米粒子應用在醣受體感測器的開發部分，我們建構具有微陣列形式的感測器，這部份的研究主要是在玻璃基材上製備金奈米粒子的自我組裝單層，再將所設計合成的醣硫醇衍生物固定化在金奈米粒子單層上，即可得到醣受體感測器。當有偵測的生化分子存在且結合時，藉由量測玻璃上金奈米粒子自我組裝單層吸收光譜訊號的差異，便可即時瞭解此分子與醣分子作用與否。我們成功建構出對於甘露糖、半乳糖及葡萄糖胺有專一結合的蛋白質感測器，且進一步在玻璃上建構兩種不同醣配基 (patterning)，測試其與蛋白質的結合分析，結果顯示此感測器具有不錯的訊號偵測及專一辨識性。 關於二氧化矽奈米粒子應用在醣受體感測分子的開發部分，我們將二氧化矽奈米粒子表面修飾香豆素醣類衍生物，當有多結合部位的蛋白質或細菌與表面修飾醣配基的二氧化矽奈米粒子專一結合時，便會造成二氧化矽奈米粒子與偵測的生物分子產生交錯連結 (cross linking)，進而造成沈澱現像，藉由肉眼的判斷即可輕易檢測蛋白質或細菌的存在。我們利用具有甘露糖殘基的二氧化矽奈米粒子檢測鼠傷寒沙門桿菌 (Salmonella typhimurium) 及黏質沙雷氏桿菌(Serratia marcescens)，此感測粒子對於上述桿菌的偵測靈敏度約105隻/毫升。Abstract This dissertation goal is development of sugar receptor(protein) sensors. The skeleton of sensors include monomer and oligomer of coumarin, gold nanoparticle and silica nanoparticle. These skeleton further combine with some sugar residue, then sensor can enable to bind with analytic protein via sugar and protein specific binding ability, finally achieve the detective goal through readout unit. Because of the sensor system have signal readout unit themselves, so can ease to detect for analytic protein that label fluorescent molecule unnecessary. We develop these sensor system for improving the proteomic research efficiency. We design and synthesis of sensor monomer consist of three components, including norbornene, coumarin and sugar moiety. We can construct of multivalent sugar-coumarin oligomer high efficiency via norbornene ring opening metathesis polymerization (ROMP). Alkene crown derivative lead into copolymer for increasing water solubility of oligomer and decreasing steric crowded of sugar residue. As a result of multivalent sugar residue and triethylene glycol construction for oligomer then enhance to bind with protein ability and raise detective limitation. The sensors utilize sugar residue to bind with multi-binding site of lectin specifically, then make interoligomeric cross-aggregation and precipitation. Consequently, we can reach detective goal by UV-visible absorbance value go down substantially. In a part of gold nanoparticle application in sensor of sugar receptor, we expect to construct microarray characteristic sensor. This research focus on fabricate self-assemble gold nanoparticle monolayer on cover glass slide, then we design and synthesis of sugar disulfide derivatives immobilize on gold nanoparticle monolayer that can get sugar receptor sensor. When biomolecule attach and bind with sugar moiety that further measure absorbance signal variation of gold nanoparticle monolayer on glass. So we can use these sensor to determine protein binding with sugar moiety or not in real time. We successful construct sugar receptor sensors of binding with mannose, galactose and glucosamine specifically. We also fabricate two different sugar ligand area on identical glass, similarly, have good detective ability and specific recognition for two different lectins. In a part of silica nanoparticle application in sensor of sugar receptor, we modified sugar-coumarin derivatives on silica nanoparticle surface. Equally, when multi-binding site of lectin and bacteria bind with sugar residue specifically of modification on silica nanoparticle surface, then produce silica nanoparticle cross-linking with biomolecule and make precipitable phenomenon in assay solution. We can ease diagnose protein and bacteria existence via naked eye. The silica nanoparticle surface modified mannose residue that can diagnose Salmonella typhimurium and Serratia marcescens. This silica nanoparticle detective limitation is about 105/mL for above bacillus.目錄 目錄 i 圖目錄 iv 表目錄 xii 簡稱用語對照表 xiii 中文摘要 xv 英文摘要 xvii 緒論 1 第一章 外源凝集素的介紹 3 1.1 外源凝結素的源由 3 1.2 外源凝結素的構造及作用機制 6 1.3外源凝結素的生物活性及功能 8 第二章 利用香豆素衍生物來製備醣受體感測分子 12 2.1 前言 12 2.1.1 醣衍生物在生物系統的辨識作用及功能 12 2.1.2 多價性 (multivalent) 醣配基與醣受體結合的探討 14 2.2 醣受體感測分子設計原理 19 2.2.1 感測分子的組成與原理 19 2.2.2 香豆素在化學感測分子的應用 22 2.3醣受體感測器單體及寡聚合物的設計合成探討 25 2.3.1 香豆素醣受體感測分子單體及寡聚合物的設計 29 2.3.2 醣-香豆素寡聚合物的製備方法 48 2.4結果與討論 58 2.4.1 醣-香豆素感測分子單體與凝集素結合分析探討 58 2.4.2 醣-香豆素寡聚合物感測分子與凝集素結合分析探討 70 2.5 結論 81 第三章 利用二氧化矽奈米粒子來製備醣受體感測器並應用在第一型 纖毛鼠傷寒沙門氏桿菌及黏質沙雷氏桿菌的檢測 82 3.1 前言 82 3.2 生物分子結合奈米粒子的相關研究 83 3.3 細菌偵測及第一型纖毛 (fimbriae) 細菌的介紹 90 3.3.1 細菌的型態及生態介紹 90 3.3.2 細菌感染的偵測方法 92 3.3.3 第一型纖毛 (fimbriae) 細菌的介紹 96 3.4 醣受體感測分子的原理、組成單元及製備方法 99 3.4.1 醣受體感測分子的組成單元及原理 99 3.4.2 香豆素-醣配基衍生物的合成策略 102 3.4.3 香豆素-醣配基衍生物合成方法的探討 104 3.4.4 二氧化矽奈米粒子的製備及修飾 114 3.4.5 醣-香豆素-二氧化矽奈米粒子與凝集素結合分析實驗 117 3.5 結果與討論 117 3.5.1 二氧化矽奈米粒子表面醣配基最佳化比例的探討 117 3.5.2 醣-香豆素-二氧化矽奈米粒子與凝集素的偵測分析 121 3.5.3 醣-香豆素-二氧化矽奈米粒子應用在第一型纖毛細菌的偵測分析 137 3.6 結論 145 第四章 利用金奈米粒子單層來製備醣受體感測器 146 4.1 前言 146 4.2醣類微陣列晶片的組成要件及相關研究 147 4.3醣受體感測器的原理、組成單元及製備方法 152 4.3.1 醣受體感測器的組成單元及原理 152 4.3.2 醣配基衍生物的合成策略 157 4.3.3 醣配基衍生物合成方法的探討 159 4.3.4 金奈米粒子製備方法 175 4.3.5 玻璃上修飾金奈米粒子單層的製備 176 4.3.6 醣衍生物連結在金奈米粒子單層的製備 178 4.3.7 醣-金奈米粒子單層與凝集素結合的吸收光譜量測 178 4.4 結果與討論 179 4.5 結論 215 實驗部分 216 壹7771643 bytesapplication/pdfen-US凝集素金奈米粒子香豆素二氧化矽奈米粒子silica nanoparticlecoumaringold nanoparticlelectinthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/51710/1/ntu-93-D89223025-1.pdf