2010-01-012024-05-17https://scholars.lib.ntu.edu.tw/handle/123456789/695895摘要：類病毒RNA基因體之cDNA庫之建構：經由生物資料庫及文獻，將已知的近30種類 病毒基因體序列持續進行匯集。由於類病毒的基因體全長介於250~430核&#33527;酸，特別 是檢疫重要性的類病毒，我們將持續以分子生物學方法及透過國際學術交流引起更 多防檢疫重要的類病毒全長的cDNA；之後，再將其建構於DNA載體上及進行單株選殖 ，以利將來cDNA的大量製備。目前，我們將針對具檢疫重要性的類病毒如Pear blister canker viroid (PBCVd) ，Peach latent mosaic viroid (PLMVd)，Hop stunt viroid (HSVd; Citrus viroid II) ，Chrysanthemum stunt viroid (CSVd)，提供 未來防檢疫技術開發來源及應用平台。2. 研發快速準確的重要防檢疫類病毒之整合性診斷技術: 包括以下 幾種整合性診斷技術的開發和建立 (a.) 選殖專一性及廣泛性核酸探針進行北方點墨雜交偵測類病 毒技術的開發：將不同類病毒的基因體序列進行分析，設計不同區域，包含保守性及特異性的序列，利 用分子選殖(由上述所製備的類病毒cDNA)或合成的方式，製備分子探針模板，製備出已 標定的cDNA探針。這些分子探針，我們將首先測試其進行點墨雜交的專一性能力及反 應條件；因此，不同類病毒全長cDNA混合植物全RNA將用做於正(positive)及負 (negative)對照組。不同類病毒間的雜合反應程度，也將用於評鑑分子探針的具有廣泛性或專一性的偵 測能力。(b.) 利用one-step RT-PCR方法進行類病毒核酸之專一及廣泛性之偵測分析：類病 毒的基因體為RNA，因此，利用PCR的方法對其進行增幅偵測需先將其RNA基因體進行反轉 錄成cDNA，然後，以設計好的具序列同源及專一性的引子對加入，進行聚合脢鏈鎖 反應。所需的引子對，其長度為18~25核&#33527;酸之間，相較於類病毒的基因體約為 300個核&#33527;酸，可選擇設計的引子對相當的多；且利用PCR增幅可大幅提高敏度。同 樣的，以保守性區域的序列或特異性區域序列所設計的引子對，可用於偵測廣泛性的類 病毒病害或是鑑定特定的類病毒種類。目前，單一步驟RT-PCR (one-step RTPCR) 的套組實驗流程將被應用於類病毒RT-PCR偵測技術的開發。如此，敏感、精準及快速 的診斷技術將是可期的。除此之外, 我們也將開發更敏銳及即時的real-time PCR類病 毒診斷技術, 並且將利用已開發出的各種類病毒引子對，收集海關樣本進行實際測 試(c.)生物性指示植物: 許多類病毒可以感染蕃茄作物，並且產生明顯的病徵相較於 其原本的寄主作物，特別是許多感染果樹的類病毒其病徵通常不明顯且易受環境因 素改變及所需時間長，因此我們將以原本在本研究室建立的類病毒接種技術上，繼續測 試不同類病毒在特定蕃茄品種病徵表現的情況，提供另一種生物性類病毒診斷的依據 3. 建立標準診斷鑑定流程:將上述研發之方法進行整合，評估各項優劣點，並找出 最佳操作模式，建立一套符合人性化且效果穩定標準診斷鑑定流程，以供後續之實 際應用<br> Abstract: This spcific aims of this current proposal are 1) Establishment of the cDNA bank for viroids; 2) Development of fast and accurant detection techniques for key quarantinable viroid-infected crops; 3) An integral SOP (standard of procedure) diangosis for key quarantinable viroids. T h e f i r s t a i m i s a t t e m p t i n g t o c o n s t r u c t a n d c o l l e c t m o r e quarantinablecDNA clones by recombinant DNA techniques and imported from overseas according to the literatures. Then, preparations of the viroid cDNAs will be used for the templates and postive controls during the development of detection techniques and future diagnosis. In the second aim, three different appraoches will be undertaken, including dot hybridization, RTPCR/real-time PCR, and bioassay, to provide an multi-strategy indetection of viroids. The spcificity and sensitivity of various probes corresponding to different viroids will be tested. Likewise, spcific and general primers sets for various viroids will be desinged for the detection the specific viroid and/or a group of viroids at the same time. Real-time PCR may also provide a quantitative and more accurant result in detection. Specific tomotoe cultivars are emloyed to be an index of bioassay for different viroids for a minimial temporal and spatial need compared to certain parental infected crops of viroids.類病毒反轉錄-聚合脢連鎖反應北方點墨雜交viroidreverse transcription- polymerase chain reactionNorthern blot