陶秘華臺灣大學：醫事技術學研究所唐士雯Tang, Shih-WenShih-WenTang2007-11-292018-07-062007-11-292018-07-062004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/62849在2000年時Oppamann發現介白素-23，這是由介白素-12的次單位p40和新發現的蛋白質p19所組成，在結構上和介白素-12類似，介白素-23的生理弁酮馬踸E記憶型CD4+ T細胞的增生及干擾素-γ的產生。 之後在2003年有關於介白素-23在抗癌方面的報告，指出表現介白素-23的CT26小鼠大腸癌細胞，雖然缺乏早期的抗腫瘤生長的能力，但在病程的中後期，會有抑制腫瘤生長的作用，但相較於介白素-12的抗癌幼蘋h較差。 為了加強介白素-23在抑制癌症生長的弁遄A我們參考介白素-12相關的一些研究；雖然介白素-12在腫瘤治療方面已經達到人體應用，但由於介白素-12所引起的系統性毒性，以至於病人產生釵h副作用，輕則如口腔炎或肝弁鉦妤`，嚴重者甚至造成病人死亡；所以在治療癌症時，為了降低介白素-12的細胞毒性，利用介白素-12結合介白素-2、或趨化激素IP-10、或介白素-18，藉以降低介白素-12的使用量，減少因介白素-12所造成的細胞毒性，並且加強抗腫瘤生長的效果。 由上述研究可知，結合二種細胞激素對於癌症的治療是有正面的幼纂A於是為了加強介白素-23在治療腫瘤的效用上，我們希望能同時讓介白素-23和介白素-2同時表現在腫瘤細胞上，測試是否可以提高介白素-23在抑制癌症的弁遄C 首先將已經有帶介白素-23的CT26與B16F1二種腫瘤細胞，用反轉錄病毒載體系統，將介白素-2的基因片段再送到細胞中，之後利用質體本身的抗藥基因，用抗生素篩選出同時有表現介白素-23及介白素-2的腫瘤細胞，接著用ELISA來定量細胞激素的表現量、細胞的倍殖時間，還有測定介白素-2的生物活性；最後利用二種不同的動物模型來做活體實驗。 結果相較於單獨只表現介白素-23或介白素-2的腫瘤細胞，同時有二種細胞激素表現的細胞其抑制小鼠皮下腫瘤效果較好。 另外在2002年首次發現和介白素-12、介白素-23結構類似的另一個新的細胞激素：介白素-27。 和介白素-23不同的地方在於，它的生理弁酮O刺激naïve CD4+ T細胞的增生及在同時亦有介白素-12的情況下，使自然殺手細胞產生大量的干擾素-γ。 以之前在介白素-23研究抗癌的方式，我們也針對此新的介白素-12相關的細胞激素介白素-27，來看其抗癌效果。 和之前的做法相同，先使用反轉錄病毒載體系統將單鏈的介白素-27基因殖入腫瘤細胞中，以抗生素篩選後，先做初步的動物實驗來觀察其抗腫瘤生長的效果，可是並沒有顯著的結果。 另外由於目前並沒有介白素-27的抗體，所以同時我們使用pShuttle-CMV/IL-27以電擊的方式植入大鼠的腿部肌肉，經數次電擊後，製造anti-IL-27抗血清初步偵測細胞表現介白素-27的量。 有了可偵測介白素-27的抗體後，才發現原本有抗藥性的腫瘤細胞表現介白素-27的量並不高，於是利用反轉錄病毒反覆感染已有表現介白素-27的細胞，增加腫瘤細胞表現介白素-27的量，最後選定第五代 (G5) 做為之後實驗用的材料。 同時並選出介白素-27表現較高的單一細胞株，和G5細胞再做一次動物實驗，目前的結果初步看起來，有介白素-27較高產量的表現的細胞，有較好之抗小鼠皮下腫瘤生長效果。 另外，在結合其他細胞激素與介白素-23的治療方面，我們另外選擇了介白素-18和趨化激素crg-2，目前只進行到篩選細胞的階段。 未來除了再進一步研究介白素-23和介白素-2治療小鼠的治病機轉外，對於趨化激素crg-2和介白素-18方面也要繼續進行實驗；在介白素-27的部分，雖然抗癌的部分已經被證實，但之後還可以純化出介白素-27的蛋白，製造介白素-27的抗體，發展偵測介白素-27的系統，並將其應用在其他疾病治療方面，像B型肝炎。The structure and T cell stimulatory effects of the recently discovered cytokine Interleukin-23 (IL-23) are similar to, but distinct from, those of Interleukin-12 (IL-12). IL-23, which composed of the p40 subunit of IL-12 and a newly identified p19 molecule, is normally secreted by activated macrophage and dendritic cells. IL-23 preferentially induces proliferation of, and Interferon-中文摘要 V 英文摘要 VII 第一章、概論 壹、癌症的免疫基因療法 1 貳、介白素-23的結構與弁?2 參、細胞激素對抑制癌症的協同作用 4 (一)介白素-2的簡介 5 (二)介白素-18的簡介 6 (三)趨化激素-crg-2的簡介 7 肆、介白素-27的結構與弁?8 伍、研究目標 9 第二章、材料與方法 第一節、質體的構築 壹、質體的製備 12 貳、以TRIZOL kit 抽取巨噬細胞RNA 12 參、反轉錄反應 (Reverse transcription) 12 肆、聚合酵素連鎖反應 (Polymerase chain reaction) 13 伍、1% 洋菜膠電泳 19 陸、DNA片段分離 19 柒、Zero BluntTM PCR cloning 20 捌、限制酵素切割反應 (Restriction enzyme digestion) 20 玖、DNA接合反應 (DNA ligation) 20 拾、細菌電擊轉殖法 (Electro transformation) 21 第二節、重組反轉錄病毒的構築 壹、反轉錄病毒的載體構築 21 貳、反轉錄病毒包裝細胞的轉染 22 參、標的細胞的感染與篩選 22 肆、反轉錄病毒的重複感染 23 伍、測定CT26對Hygromycin的感受性 24 陸、細胞的倍殖時間 24 柒、細胞的限數稀釋法 24 第三節、蛋白質在真核細胞中的表現 壹、真核細胞的轉染 (Transfection) 25 貳、免疫沉澱法 (Immunoprecipitation) 26 參、細胞激素酵素連結免疫吸附反應(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA) 27 肆、免疫點漬法 (Dot blot) 27 伍、細胞激素之生物活性測定 28 第四節、動物實驗 壹、實驗動物 28 貳、使用的細胞株及質體 28 參、質體DNA的製備 31 肆、癌細胞的注射 31 伍、實驗肺轉移的觀察 32 陸、大鼠的免疫注射方式 32 柒、活體血液處理方式 33 捌、統計 33 第三章、實驗結果 第一部、介白素-23與介白素-2在抑制癌症上的協同作用 第一節、介白素-2的載體構築 34 第二節、同時表現介白素-23及介白素-2的CT26癌細胞 壹、製造同時表現介白素-23與介白素-2的癌細胞 34 貳、利用限數稀釋法挑選高表現量的單株癌細胞 35 參、介白素-2及介白素-23在CT26癌細胞的表現量 35 肆、CT26癌細胞分泌之介白素-2的生物活性分析 36 伍、經反轉錄病毒感染的CT26癌細胞的細胞倍殖時間 37 第三節、BALB/c小鼠模式的動物實驗 37 壹、對於BALB/c小鼠皮下腫瘤生長的影響 (一) 38 貳、對於BALB/c小鼠皮下腫瘤生長的影響 (二) 38 第四節、同時表現介白素-23及介白素-2的B16F1黑色素癌細胞 壹、介白素-2及介白素-23在B16F1黑色素癌細胞的表現量 39 貳、B16F1黑色素癌細胞分泌之介白素-2的生物活性分析 40 參、經反轉錄病毒感染的B16F1黑色素癌細胞的細胞倍殖時間 40 第五節、C57BL/6小鼠模式的動物實驗 壹、對於C57BL/6小鼠皮下腫瘤生長的影響 (一) 40 貳、對於C57BL/6小鼠皮下腫瘤生長的影響 (二) 41 參、對於C57BL/6小鼠體內癌轉移的抑制效果 41 第二部、介白素-27在在抑制癌症上的效果 第一節、介白素-27之構築 壹、建構介白素-27的DNA 42 貳、介白素-27質體之基因表現 44 第二節、製造抗小鼠介白素-27的抗體 壹、製造表現介白素-27的3T3細胞 44 貳、抽取3T3/scIL-27的mRNA間接證明有介白素-27的表現 44 參、用免疫點漬法測試大鼠血清中的抗小鼠介白素-27的抗體 45 第三節、製造表現介白素-27的CT26癌細胞或B16F1黑色素癌細胞並以動物實驗初步測試是否具有抑制癌症的弁? 壹、製備表現介白素-27的腫瘤細胞 45 貳、表現介白素-27的CT26癌細胞對於BALB/c小鼠腫瘤生長的影響 46 參、表現介白素-27的CT26癌細胞對於BALB/c小鼠體內癌轉移的保護效果 46 第四節、介白素-27的蛋白質表現與動物實驗 壹、利用免疫點漬法確定介白素-27的表現量 47 貳、反轉錄病毒的重複感染 47 參、利用限數稀釋法挑選高表現量的單株癌細胞 48 肆、用免疫點漬法比較CT26癌細胞表現介白素-27的含量 48 伍、表現介白素-27的CT26癌細胞的細胞倍殖時間 49 陸、表現介白素-27的CT26癌細胞對於小鼠皮下腫瘤生長的影響 49 柒、用免疫點漬法比較B16F1癌細胞表現介白素-27的含量 49 捌、表現介白素-27的B16F1癌細胞的細胞倍殖時間 50 玖、表現介白素-27的B16F1黑色素癌細胞對於小鼠皮下腫瘤生長的影響 50 第三部、其他細胞激素與介白素-23對抑制癌症的協同作用 第一節、同時表現介白素-23和介白素-18的腫瘤細胞 壹、介白素-18的載體構築 50 貳、製備同時表現介白素-23與介白素-18的癌細胞 51 第二節、同時表現介白素-23和趨化激素crg-2的腫瘤細胞 壹、製備同時表現介白素-23與趨化激素crg-2的癌細胞 51 第四章、討論 52 第五章、參考文獻 58 圖表 69 附錄一 110 附錄二 111 附錄三 116 附錄四 117 附錄五 1181042751 bytesapplication/pdfen-US癌症介白素-2介白素-23協同效果anti-tumorsynergisticIL-2IL-23otherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/62849/1/ntu-93-R91424013-1.pdf