張鴻民臺灣大學：食品科技研究所陳宣諭Chen, Shiuan-YuShiuan-YuChen2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/56288巴西洋菇具有增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗致突變等功用。在此研究中分成細胞與動物兩部分進行實驗。在細胞實驗中，利用4℃冷水粗萃物、50℃水粗萃物、沸水粗萃物、4℃冷水粗萃酒精沉澱物與沸水粗萃酒精沉澱物對人類白血病U937細胞株進行抑制及誘導分化之作用，並探討巴西洋菇對U937細胞週期蛋白控調機制。由實驗結果顯示，沸水粗萃酒精沉澱物具有較高的直接生長抑制效果，在濃度400μg /mL的生長抑制率可達78%，再由流式細胞儀測得巴西洋菇沸水粗萃酒精沉澱物於濃度400μm/mL作用五天時，可使U937細胞週期停滯於G2/M期，但無凋亡之現象產生。 在動物實驗中，於Balb/c雄鼠尾部靜脈注射鼠大腸癌 (CT26) 細胞株，建立腫瘤轉移肺臟之模式，並餵食不同劑量之巴西洋菇沸水粗萃酒精沉澱物，探討巴西洋菇對抗腫瘤轉移之效果。結果顯示，控制組腫瘤轉移肺臟上之群落個數，於每隻小鼠兩葉肺臟有121個小結節；依小鼠每公斤體重給予200、400與600 mg/kg bw/day劑量之組別，其腫瘤轉移肺臟上之群落個數，於每隻小鼠兩葉肺臟分別有36、36、55個小結節，均能有效抑制腫瘤轉移肺臟 (p<0.05)。於顯微鏡下觀察肺臟及腎臟病理組織切片，於肺臟組織切片圖可以明顯看到腫瘤轉移後肺臟細胞間質增厚使肺臟組織產生病變；由腎臟組織切片圖顯示巴西洋菇沸水粗萃酒精沉澱物在此3組劑量下對小鼠腎臟細胞不具有毒性。Abstract Agaricus blazei (AB) is a dietary mushrooms and known for its immunoenhancing, antitumor, antioxidation, antiviral, and anti- mutagenesis actions. In the present study, furiting body of AB was used to investigate the immunoenhancing and antitumor activities in vitro and in vivo. First, 4℃ cold-water extracts, boiled-water extracts, and ethanol (75%) precipitates of both cold- and boiled-water extracts from AB were incubated with human leukemic U937 cells to observe the changes in growth inhibition (%) and differentiation-inducing effect by conditioned medium (CM) method or co-cultivation method, followed by the cell cycle arrest test by a flow cytometry. Results showed that remarkable growth inhibition (about 78 %) was observed when U937 cells were incubated with 400 mg/mL of ethanol precipitates of boiled-water extracts from AB, while cell cycle of U937 cells were arrested at G0/G1 phase when were incubated for 5 days with ethanol precipitates of boiled-water extracts from AB without apoptosis occurrence (< 0.2 %). On the other hand, in vivo, male Balb/c mice, orally administrated with different amounts (200~600 mg/kg/day) of ethanol precipitates of boiled-water extracts from AB, were injected with 2 × 105 CT26 (colon tumor) cells intraveneously via a tail vein to establish pulmonary metastases and then sacrificed after 12 days of inoculation. Metastatic lung nodules in control group were counted to be 121/mouse and experimental group fed with 200, 400, and 600 mg/kg/day were counted to show 36/mouse, 36/mouse, and 55/mouse, respectively, revealing significantly (p < 0.05) the anti-metastatic effect of AB. Histopathologic results in lungs was also consistent with the finding in vivo. Insignificant changes in renal functions and immunohistograph were observed in mice fed with Agaricus blazei at those three dosages.總目錄 中文摘要…………………………………………………………………Ⅰ 英文摘要…………………………………………………………………Ⅱ 圖目錄……………………………………………………………………Ⅶ 表目錄……………………………………………………………………Ⅸ 第一章 總論………………………………………………………………1 壹 前言………………………………………………………………….1 貮 文獻整理…………………………………………………………….2 一、 以巴西洋菇對U937細胞生長抑制並探討其對細胞週期蛋白之 調控…..……………………………………………………………2 第一節 食品與免疫之作用…………………………………………2 1-1-1.1 食品生理活性物質與免疫………………………………2 1-1-1.2 免疫反應…………………………………………………3 第二節 巴西洋菇之簡介……………………………………………6 1-1-2.1 巴西洋菇之起源………………………………………….6 1-1-2.2 巴西洋菇之分類與型態………………………………….6 1-1-2.3 巴西洋菇之化學成分物質……………………………….7 1-1-2.4 巴西洋菇之生理活性研究……………………………….8 1-1-2.5 巴西洋菇藥理相關研究………………………………….8 第三節 白血病與人類白血病細胞株U937之簡介………………13 1-1-3.1 白血病……………………………………………………13 1-1-3.2 人類白血病U937細胞株……………………………….13 第四節 細胞週期之調控……………………………………………15 1-1-4.1 細胞週期…………………………………………………15 1-1-4.2 細胞週期之調控因子……………………………………16 二 以尾靜脈注射CT26之動物模式探討巴西洋菇抗腫瘤轉移之機 制………………………………………………………………………19 第一節 小鼠大腸癌細胞株CT26之簡介…………………………..19 1-2-1.1 CT26細胞株之特性……………………………………..19 1-2-1.2 CT26之生瘤性…………………………………………..19 第二節 癌的轉移…………………………………………………….20 1-2-2.1 轉移作用………………………………………………...20 1-2-2.2 基質金屬蛋白酶與腫瘤轉移之關係…………………...20 1-2-2.3 MMP-2與MMP-9在腫瘤之研究………………………21 1-2-2.4 組織觀察…………………………………………………23 1-2-2.4-1 組織切片…………………………………………….23 1-2-2.4-2 組織切片之製作…………………………………….23 第二章 巴西洋菇對人類白血病U937細胞株生長抑制機制…………..25 第一節 前言…………………………………………………………25 第二節 實驗材料……………………………………………………26 2-2.1 實驗樣品來源……………………………………………..26 2-2.2 實驗細胞…………………………………………………..26 2-2.3 實驗藥品及試劑…………………………………………..26 2-2.4 實驗器材…………………………………………………..28 2-2.5 儀器設備…………………………………………………..28 第三節 實驗方法…………………………………………………..31 2-3.1 巴西洋菇水粗萃物與酒精沉澱物之製備……………….31 2-3.2 U937細胞株之培養………………………………………31 2-3.3 U937生長抑制率測定……………………………………32 2-3.4 細胞週期生長抑制機制之分析測定……………………..33 2-3.5 統計分析…………………………………………………37 第四節 結果……………………………………………………….38 2-4-1 巴西洋菇對U937細胞之影響………………………….38 2-4-1.1 巴西洋菇水萃出物對U937細胞之影響……………38 2-4-1.2 巴西洋菇活性物質之篩選…………………………...41 2-4-1.3 巴西洋菇生長抑制率圖……………………………...43 2-4-2巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對U937細胞生長抑制情 況…………………………………………………………..45 2-4-2.1 細胞週期之分析……………………………………...45 第五節 討論……………………………………………………….51 第三章 巴西洋菇經由活體之調節抑制腫瘤轉移之研究………………54 第一節 前言………………………………………………………….54 第二節 實驗材料…………………………………………………….55 3-2.1 實驗樣品來源……………………………………………...55 3-2.2 實驗動物…………………………………………………...55 3-2.3 實驗細胞株………………………………………………...55 3-2.4 實驗藥品及試劑…………………………………………...55 3-2.5 實驗器材…………………………………………………...56 3-2.6 儀器設備…………………………………………………...57 第三節 實驗方法…………………………………………………….59 3-3.1 巴西洋菇沸水萃酒精沉澱物……………………………...59 3-3.2 CT26細胞株培養…………………………………………..59 3-3.3 動物飼養…………………………………………………...60 3-3.4 CT26生長抑制率測定……………………………………..60 3-3.5 動物實驗…………………………………………………...61 3-3.6 統計分析…………………………………………………..66 第四節 結果………………………………………………………….67 3-4-1 巴西洋菇對CT26細胞之影響…………………………...67 3-4-1.1 巴西洋菇對CT26生長抑制率圖……………………67 3-4-1.2 細胞週期之分析……………………………………...69 3-4-2 動物實驗…………………………………………………..74 3-4-2.1體重變化………………………………………………74 3-4-2.2 白血球數目變化……………………………………...76 3-4-2.3 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對Balb/c雄鼠脾臟之 影響…………………………………………………...79 3-4-2.4 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對Balb/c雄鼠脾臟細 胞增生能力之影響……………….…………………..81 3-4-2.5 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物抑制肺臟轉移之效 果……………………………………………………...83 3-4-2.6 組織病理切片圖……………………………………...85 3-4-2.7 小鼠脾臟細胞條件培養液中細胞激素含量………...88 第五節 討論………………………………………………………….91 第四章 參考文獻…………………………………………………………95 圖目錄 圖 1-1. 巴西洋菇外觀呈現淡褐色人工栽培於堆肥上………………..12 圖 1-2. 細胞週期調控…………………………………………………..18 圖 1-3. 基質金屬蛋白酶之分類及結構………………………………..22 圖 2-1. 濃度400μg/mL之沸水萃出物及沸水萃出酒精沉澱物直接 作用對U937細胞培養一、三、五天之生長抑制圖…..…...44 圖2-2. 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對U937細胞培養一、三、五 天後細胞週期變化……………………………………………..47 圖2-3. 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對U937細胞週期之影響 (A) 200μg /mL (B) 400μg /mL (C) 600μg /mL (D) 控制組刺激 U937細胞一天之結果…………………………………………48 圖2-4. 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對U937細胞週期之影響 (A) 200μg /mL (B) 400μg /mL (C) 600μg /mL (D) 控制組刺激 U937細胞三天之結果…………………………………………49 圖2-5. 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對U937細胞週期之影響 (A) 200μg /mL (B) 400μg /mL (C) 600μg /mL (D) 控制組刺激 U937細胞五天之結果…………………………………………50 圖3-1. 巴西洋菇之沸水萃出酒精沉澱物對CT26細胞的間接與直接 生長抑制率之比較……………………………………………..68 圖3-2. 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對CT26細胞培養24、48、72 hr後細胞週期變化……………………………………………..71 圖3-3. 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對CT26細胞週期之影響 (A) 200μg /mL (B) 400μg /mL (C) 600μg /mL (D) 控制組刺激 CT26細胞24 hr之結果………………………………………..72 圖3-4. 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對CT26細胞週期之影響 (A) 200μg /mL (B) 400μg /mL (C) 600μg /mL (D) 控制組刺激 CT26細胞72 hr之結果………………………………………….73 圖3-5. 於Balb/c雄鼠尾部靜脈注射CT26腫瘤細胞並經口服不同劑 量 (200、400與600 mg/kg bw) 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱 物、腹腔注射5-FU在12天飼養期間下體重之變化………….75 圖3-6. 於Balb/c雄鼠尾部靜脈注射CT26腫瘤細胞並經口服不同劑 量 (200、400與600 mg/kg bw) 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱 物、腹腔注射5-FU在12天飼養期間其白血球數目之變化….77 圖3-7. 餵食巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物對Balb/c雄鼠脾臟細胞增 生能力之影響……………………………………..……………...82 圖3-8. 實驗小鼠之肺臟組織切片圖……………………………………..86 圖3-9. 實驗小鼠之腎臟組織切片圖…………………………………..…87 圖3-10. 餵食不同劑量 (200, 400,600 mg/kg bw) 巴西蘑菇沸水粗萃 酒精沉澱物及腹腔注射5-FU之老鼠皮臟細胞經PHA刺激 培養三天後條件培養液中所含之IL-2含量…………….…..…89 圖3-11. 餵食不同劑量 (200, 400,600 mg/kg bw) 巴西蘑菇沸水粗萃 酒精沉澱物及腹腔注射5-FU之老鼠皮臟細胞經PHA刺激 培養三天後條件培養液中所含之TNF-α含量……………..…90 表目錄 表1-1. 巴西洋菇子實體之成分組成……………………………………7 表1-2. 巴西洋菇相關研究之文獻整理…………………………………9 表2-1. 巴西洋菇之4℃冷水粗萃物、50℃水粗萃物、沸水粗萃物對 U937細胞的間接與直接生長抑制率之比較…………………40 表2-2. 巴西洋菇之4℃冷水粗萃酒精沉澱物、沸水粗萃酒精沉澱物對 U937細胞的間接與直接生長抑制率之比較…………………42 表3-1. 小鼠分組資料…………………………………………………...62 表3-2. 於Balb/c雄鼠尾部靜脈注射CT26腫瘤細胞並經口服不同劑 量 (200、400與600 mg/kg bw) 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物 、腹腔注射5-FU在12天飼養期間其白血球數目之變化...…78 表3-3. 尾靜脈注射CT26腫瘤細胞之Balb/c雄鼠經飼食不同劑量樣 品後其脾臟重量與脾臟細胞數之比較………………………..80 表3-4. 巴西洋菇沸水萃出酒精沉澱物抑制肺臟轉移之效果………...841828041 bytesapplication/pdfen-US巴西洋菇轉移U937pulmonary metastasesAgaricus blazeithesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/56288/1/ntu-93-R91641001-1.pdf