黃銓珍臺灣大學:生化科學研究所彭文欣Peng, Wen-HsinWen-HsinPeng2010-05-042018-07-062010-05-042018-07-062008U0001-1607200816471700http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/178814胃癌全球罹患率與致死率皆高居癌症的第二位，但我們對胃癌之致病機轉了解仍有限。實驗室以差異性表現分析，發現Rhotekin (RTKN) 蛋白在胃癌組織中表現量高於週邊正常組織。目前對於 RTKN 的功能研究知道其會和 Rho、 Tax interacting protein-1 一起促進 serum response elememt 的活化，而我們實驗室之前則發現有RTKN 大量表現的細胞具有抗凋亡的能力可能是因 RTKN 影響NF-κB的活性，另外也發現 RTKN 降低了 RhoA 下游 ROCK 的活性並造成Rac 活性上升而影響細胞骨架的重整，減少 stress fiber 生成並增加細胞 surface protrusion 和移動的能力。在本論文中，我們進一步探討 RTKN 在細胞轉型(cell transformation)遷移(migration)過程中所扮演的角色。我們根據細胞株中所擁有RTKN 的表現量挑選出合適的細胞株，分別在低表現量的細胞株(H1299, AZ-521)內大量表現RTKN以及在高表現量的細胞株(NUGC-3)內利用sh-RNA 專一性抑制內生性的RTKN 之表現。初步發現，過度表現RTKN 使得細胞喪失接觸性抑制(contact inhibition ofrowth)而造成細胞飽和度增加，促使細胞骨架重整造成細胞型態改變，增加細胞移(Migration)及細胞入侵(Invasion)之能力，並且發現細胞過度表現RTKN 促進其非固著性依賴生長(anchorage-independent growth)之能力。這些現象說明了RTKN 參與了細胞轉型(transformation)及遷移(migration)，因此可能與胃癌生成以轉移惡化有關。我們藉由本研究之分析RTKN 所給予細胞轉型之特性，建議RTKN 於胃癌生成或惡化中扮演一重要的角色及可能之機制。Gastric cancer is ranked the fourth common cancer and the second leading cause ofancer death worldwide (almost 1 million deaths/year).Using ordered differentialisplay, we have identified rhotekin, the gene encoding Rho effector rhotekin (RTKN)s one of the genes overexpressed in human gastric cancer. To further understand theole of Rho/RTKN involved in the pathogenic development of GC, in this study, weropose to dissect Rho signaling pathways that are mediated by RTKN, and specialfforts will be focused on the ones contribute to malignant transformation and tumoretastasis. To assess the function of RTKN in cellular transformation, we ectopicallyxpressed RTKN in cultured cell, and monitored the biological readouts of RTKNxpression. The data shown, RTKN expression suppressed contact inhibition ofovement in both H1299 as well as HEK293 cells. RTKN In consistence,verexpression of RTKN conferred an increased saturation density in H1299 cells.verexpression induced extensive cell surface protrusions with a concomitant decreasef stress fibers and focal adhesions. We have further generated stable clones : H1299nd AZ-521, RTKN low expresser that stably expressed RTKN, and NUGC-3 , RTKNigh expresser that stably knock downed RTKN, and tested for transforming activity.he stable clone displayed increased migration and invasion ability when compared tohe parental cells. In addition, the stable clone developed anchorage-independent growthn soft agar whereas the parental cells showed reduced growth in soft agar. Takenogether, we conclude that overexpression of RTKN may promote cell transformationnd cell migration, and thus and thus contribute to tumor metastasis.目 錄目 頁碼錄 Ⅰ目錄 Ⅳ寫表 Ⅵ文摘要 Ⅶ文摘要 Ⅷ一章 緒論 1一節 胃癌之簡介 1二節 癌症之生成 5三節 Rhotekin(RTKN) 10二章 研究目標 12三章 材料與方法 13一節 細胞培養 (Cell culture) 13二節 西方墨點轉漬分析 (Western blot) 14三節 轉染反應 (Transfection) 15四節 製備穩定細胞株 (stable clone) 16五節 免疫螢光染色 (Immunofluorescence stain) 17I六節 細胞飽和度測試 18七節 細胞增生分析 (WST-1 assay) 18八節 反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR) 19九節 基質金屬酶(MMP)酶譜法 (Zymography) 20十節 細胞遷移與入侵能力測試 (Migration and Invasion assay) 21十一節 洋菜軟膠方法(Soft agar assay)分析非固著依賴性細胞生(Anchorage-independent growth assay, AIG)2四章 結果 24一節 探討RTKN 對細胞轉型之影響 24一) 過度表現RTKN 使細胞喪失接觸性抑制(contactnhibition of growth)而造成細胞飽和度增加4二) 過度表現RTKN 對於細胞生長速率之影響 25三) 過度表現RTKN 使細胞型態改變 26四) 過度表現RTKN 對細胞骨架之影響 27五) 過度表現RTKN 增加細胞遷移(Migration)及細胞入(Invasion)之能力8六) 分析RTKN 穩定細胞株中MMP 之含量及活性 29七) 細胞過度表現RTKN 促進其非固著性依賴生長anchorage-independent growth)之能力0二節 探討胃癌細胞中RTKN 的含量對細胞轉型之影響 31一) 於AZ-521 胃癌細胞株中過度表現RTKN 31二) 於NUGC-3 胃癌細胞株中剔除RTKN 之表現 32五章 討論 34II一節 探討RTKN 促使細胞飽和度增加 34二節 探討RTKN 使細胞型態改變並且造成細胞骨架之重整 35三節 探討RTKN 增加細胞遷移 (Migration)及細胞入侵Invasion)之能力6四節 探討RTKN 促進細胞非固著性依賴生長Anchorage-independent growth)之能力8amp;#63851;考文獻 40 46錄 67表一、本研究所使用之質體DNA 67表二、H1299/RTKN 穩定表現細胞株之特性 68圖一、RTKN過度表現不影響組成粘著斑蛋白質之表現 69圖二、Boyden chamber 結構示意圖 70application/pdf19732550 bytesapplication/pdfen-US癌症細胞轉型細胞遷移細胞入侵非固著性依賴生長CancerCell transformationCell migrationCell invasionAnchorage-independent growth[SDGs]SDG3http://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/178814/1/ntu-97-R95b46012-1.pdf