黃穰臺灣大學：海洋研究所吳裘第Wu, Chiu-TiChiu-TiWu2007-11-272018-06-282007-11-272018-06-282007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/56529前人的研究指出含鈣藻類的多醣體和蛋白質可以刺激免疫細胞活性及抑制腫瘤。惟相關研究少有利用鈣化的海藻做實驗材料。本論文實驗以寬珊藻為材料，是屬於有鈣化的紅藻。將寬珊藻以磷酸鹽緩衝食鹽水( PBS )萃取，再以老鼠巨噬細胞做體外活性檢測，以評估寬珊藻之活性蛋白的免疫能力。結果顯示寬珊藻未經過酸前處理的蛋白質萃取物較經酸前處理者對於小老鼠的巨噬細胞有較高的刺激增殖現象，意謂鈣在寬珊藻的蛋白質免疫活性上扮演重要角色。將寬珊藻以PBS萃取，經過硫酸銨飽和溶液沉澱，再經過膠體過濾及離子交換層析之後，得到具免疫功能的活性蛋白質，簡稱MRP，在加入相當低的蛋白質濃度10.9 ngmL-1時，巨噬細胞增殖達168％ 。MRP蛋白質分子量為105 kDa，惟MRP在藻體的含量非常低。此外，本實驗也以硫酸銨飽和溶液40~60% 所分劃出藻膽蛋白，並經由DEAE離子交換層析後，得到藻紅蛋白。此藻紅蛋白在吸收光譜上，出現兩個吸收高峰，分別為495nm及565nm，還有一545nm的肩峰，為典型的R型藻紅蛋白。藻紅蛋白亦能使巨噬細胞增殖，但其增殖活性不如MRP。由本論文實驗結果可得知鈣化的藻類在免疫活性具有研究及開發的潛力。目錄 頁次 中文摘要………………………………………………………………………………i 英文摘要……………………………………………………………………...………ii 壹、 前言.......................................................................................................................1 貳、 文獻整理…………………………………………………………………...…....3 一、 免疫系統......................................................................................................3 二、 巨噬細胞的活化…………………………………………………………..3 三、 免疫活性分析- MTT還原法……………………………………………...4 四、 海藻多醣類及蛋白質之免疫活性調節與抗腫瘤細胞…………………..4 五、 鈣離子之免疫活性………………………………………………………..5 參、 材料與方法………………………………………………………...…………...7 一、 實驗材料及設備…………………………………………………………...7 二、 實驗方法…………………………………………………………………...9 肆、 結果……………………………………………………...…………………….14 一、 有無以酸( HCl )處理之寬珊藻PBS萃取液老鼠巨噬細胞增情形…...14 二、 不同寬珊藻萃取液對老鼠巨噬細胞增殖情形…………………………14 三、 不同萃取時間之寬珊藻PBS 萃取液對於老鼠巨噬細胞增殖的影響..14 四、 寬珊藻之蛋白質萃取液硫酸銨飽和濃度分劃對老鼠巨噬細胞增值的影響…………………………………………………………………………15 五、不同月份採集的寬珊藻萃取液對老鼠巨噬細胞增殖的影響….15 六、不同採集地點之寬珊藻以硫酸銨溶液沉澱之萃取物( 60~80％ ) 對老鼠巨噬細胞增殖情形……………………………………....15 七、寬珊藻免疫活性蛋白的分離與純化……………………………16 八、電泳分析…………………………………………………………16 九、寬珊藻藻紅蛋白純化及吸收光譜………………………………17 十、寬珊藻之藻紅蛋白免疫活性分析………………………………….17 伍、討論………………………………………………………….…....…18 陸、參考文獻…………………………………………………………….22 圖 目 錄 圖一、寬珊藻之活性蛋白質純化流程圖…………………..……...……28 圖二、有無以酸前處理之寬珊藻PBS萃取液對於巨噬細胞增殖的影響……….29 圖三、不同寬珊藻萃取液對巨噬細胞增殖情的影響………….…………….....30 圖四、不同萃取時間長短之寬珊藻PBS 萃取液對於巨噬細胞增殖的影響……31 圖五、不同硫酸銨飽和濃度分劃出的蛋白質含量百分比………………………..32 圖六、不同硫酸銨飽和濃度分劃出之蛋白質萃取液對巨噬細胞增殖的影響…...33 圖七、不同月份寬珊藻硫酸銨分劃萃取液對巨噬細胞增殖的影響…………..…34 圖八、船帆石寬珊藻之硫酸銨分劃出蛋白質之萃取液影響巨噬細胞增殖的情 形…………………………………………………………………………….35 圖九、寬珊藻蛋白質的Sephadex G-75膠體過濾層析圖…………... 36 圖十、經Sephadex G-75 column膠體過濾層析之高峰( G1、G2、G3 ) 位置之蛋白質溶液對老鼠巨噬細胞增殖的影響……………...37 圖十一、 Sephadex G-75之標準品膠體過濾層析圖……………………..…….…38 圖十二、寬珊藻蛋白質H1的QFF離子交換層析圖……………..…………39 圖十三、依Lowry 法測定蛋白質含量之檢量線…………………..…40 圖十四、純化蛋白質MRP促進巨噬細胞增殖的活性……………………..…….41 圖十五、不同純化階段之蛋白質萃取液的Native-PAGE電泳圖... ………………42 圖十六、藻膽蛋白的DEAE離子交換層析圖…………………………………….43 圖十七、藻紅蛋白D1的DEAE離子交換層析圖………………………………44 圖十八、不同純化階段之寬珊藻藻紅蛋白萃取液的Native-PAGE電泳圖…….45 圖十九、純化之寬珊藻紅蛋白吸收光譜…………………..……………………46 圖二十、寬珊藻藻紅蛋白蛋白質促進巨噬細胞增殖的情形……………………..47 表 目 錄 表一. 寬珊藻蛋白質萃取液之增殖活性及活收率................................................48 表二. 寬珊藻藻紅蛋白之純化度及回收率………………………………...…….49 附 錄 附錄一…………………………………………………………………...50 附錄二………………………………………………………………..….51998414 bytesapplication/pdfen-US紅藻寬珊藻免疫藻紅蛋白鈣Marine algaeMastophora roseaphycoerythrinmacrophageimmune[SDGs]SDG14thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/56529/1/ntu-96-R94241203-1.pdf