王金和臺灣大學:獸醫學研究所陳怡彤Chen, Yi-TungYi-TungChen2010-05-042018-07-092010-05-042018-07-092009U0001-1407200913114900http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/178937台灣的雞場常發生H6N1低病原性家禽流行性感冒病毒之感染，目前以酵素連結免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assays；ELISA) 的方式檢測抗體與抗原皆無法區分出H6亞型，本研究之目的為發展可檢測H6亞型家禽流行性感冒病毒抗體與抗原之ELISAs。為檢測H6亞型抗體，利用專一性抗H6N1病毒之單株抗體作為追蹤子 (tracer)，分別利用H6N1全病毒及HA1重組蛋白質作為塗鍍抗原發展病毒阻斷型ELISA (virus blocking ELISA；virus-bELISA) 和重組HA1蛋白質阻斷型ELISA (recombinant HA1 blocking ELISA；rHA1-bELISA)。以血球凝集抑制試驗 (hemagglutination inhibition test；HI test) 作為檢測血清中H6亞型抗體之金標準 (gold standard)。兩種bELISA皆以138個HI test陰性血清評估其cut-off值，virus-bELISA之cut-off值為30%，應用於其他血清測得敏感性為100% (184/184)，而特異性為97% (210/216)。此virus-bELISA應用於田間能比HI test能早期監測到H6亞型抗體。另外，rHA1-bELISA之cut-off值為22%，敏感性為98% (180/184)，而特異性為94% (203/216)，應用於田間血清之抗體檢測其敏感性較HI test低。利用兩株專一性抗H6N1之單株抗體分別作為capture antibody及detector antibody發展抗原捕捉型酵素連結免疫吸附法 (antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay；AC-ELISA) 以檢測H6亞型抗原。以家禽呼吸道病毒包括H5亞型家禽流行性感冒病毒、傳染性支氣管炎病毒及新城病病毒測試AC-ELISA之特異性，顯示AC-ELISA只能檢測到H6亞型家禽流行性感冒病毒，具有良好之特異性。另外以10株H6亞型病毒株檢測AC-ELISA之靈敏度，結果顯示最低可檢測到1.3×105 EID50/0.1 mL的病毒量。Low pathegenic avian influenza virus of H6N1 has circulated frequently in domestic chickens in Taiwan. Nowadays, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for detecting antibody and antigen can’t differentiate H6 subtype. The purposes of this study are to develop ELISAs for detecting avian influenza virus H6 subtype antibody and antigen. For H6 subtype antibody detection, the monoclonal antibody specifically against H6N1 virus was used as the tracer, whole H6N1 virus and HA1 recombinant protein were used as coating antigens to develop virus blocking ELISA (virus-bELISA) and recombinant HA1 blocking ELISA (rHA1-bELISA), respectively. Hemagglutination inhibition test (HI test) was taken as a gold standard for detection of H6 antibody in sera. One hundred and thirty-eight HI test negative sera were used to evaluate the cut-off values of the virus-bELISA and rHA1-bELISA. The cut-off value of the virus-bELISA was 30%. The sensitivity and specificity were 100% (184/184) and 97% (210/216), respectively. The virus-bELISA detected H6 antibody earlier than HI test in the field. On the other hand, the cut-off value of the rHA1-bELISA was 22%. The sensitivity and specificity were 98% (180/184) and 94% (203/216), respectively. However, HI test was more sensitive than rHA1-bELISA for monitoring H6 antibody in the field. For H6 antigen detection, two monoclonal antibodies specifically against H6N1 virus were used as capture antibody and detector antibody respectively for development of the antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assays (AC-ELISA) Poultry respiratory viruses including H5 subtype avian influenza virus, infectious bronchitis virus and Newcastle disease virus were tested by the AC-ELISA for specificity analysis. The results revealed that the AC-ELISA had good specificity. Ten H6N1 viruses were used to evaluate the detection limits of the AC-ELISA. The results showed the AC-ELISA could detect at least 1.3×105 EID50/0.1 mL of virus.第一章 序言 1二章 文獻回顧 3一節 病毒之病原學 3-1.1 病毒分類 3-1.2 結構與特徵 3-1.2.1 蛋白質結構與功能 4-1.3 物理化學特性 9-1.4 病毒命名 9-1.5 病毒複製機制 10-1.6 病毒變異性 11-1.7 病毒病原性 12二節 病毒流行病學 13-2.1 宿主範圍 13-2.2 病毒傳播機制 13-2.3 病毒感染機制 13-2.4 臨床症狀與病理變化 14-2.5 宿主免疫反應 15-2.6 全球疫情與台灣現況 15三節 診斷方法 17-3.1 病毒抗原檢測 17-3.1.1 病毒分離 17-3.1.2 瓊脂膠體免疫擴散法 17-3.1.3 血球凝集試驗 18-3.1.4 血球凝集抑制試驗及神經胺酸酶抑制試驗 18-3.1.5 反轉錄聚合酶鏈鎖反應 19-3.1.6 即時反轉錄聚合酶連鎖反應 19-3.1.7 反轉錄酶恆溫式圈環形核酸增幅法 20-3.1.9 微陣列分析 21-3.1.10 免疫螢光染色 21-3.2 病毒抗體檢測 21-3.2.1 瓊脂膠體免疫擴散法 21-3.2.2 血球凝集抑制試驗 22-3.2.3 神經胺酸酶抑制試驗 22四節 酵素連結免疫吸附法 (ELISA) 22-4.1 ELISA原理 22-4.2 ELISA分類 23-4.2.1 直接型ELISA 23-4.2.2 間接型ELISA 23-4.2.3 抗原捕捉型ELISA 24-4.2.4 競爭型ELISA 25-4.2.5 阻斷型ELISA 25-4.3 ELISA應用 25五節 單株抗體 26-5.1 單株抗體原理 26-5.2 單株抗體應用 26三章 材料與方法 27一節 病毒製備 27-1.1 病毒來源 27-1.2 病毒增殖 27-1.3 病毒定量 28-1.3.1 血球凝集試驗 28-1.3.2 50%雞胚胎蛋感染劑量測定 (EID50) 28-1.3.3 病毒核酸檢測 29-1.4 病毒濃縮 31-1.5 病毒純化 31-1.6 蛋白質定量 32二節 單株抗體製備 32-2.1 單株抗體製備、篩選及純化 32-2.2 單株抗體分析 33-2.2.1 Isotype分析 33-2.2.2 免疫墨點法 33-2.2.3 聚丙烯醯胺膠片電泳 (SDS-PAGE) 34-2.2.4 西方墨點法 35-2.2.5 血球凝集抑制試驗 35-2.2.6 蛋白質定量 36-2.2.7 間接型ELISA 36三節 發展檢測H6亞型抗體之阻斷型ELISA 37-3.1 發展塗鍍全病毒的阻斷型ELISA (virus-bELISA) 37-3.1.1 單株抗體標示過氧化氫酶 37-3.1.2 最佳化virus-bELISA條件 37-3.1.3 血清樣本 38-3.1.4 virus-bELISA操作流程 38-3.1.5 A450值轉換成血清抑制百分比 39-3.1.6 virus-bELISA之cut-off值、敏感性、特異性與一致性分析 39-3.1.7 15種HA亞型的高免血清之交叉反應分析 40-3.1.8 比較HI test與virus-bELISA之H6抗體監測能力 40-3.1.9 應用virus-bELISA於田間血清檢測 40-3.2 塗鍍HA1重組蛋白質的阻斷型ELISA (rHA1-bELISA) 40-3.2.1 病毒HA1基因選殖 40-3.2.2 重組蛋白質之表現 45-3.2.3 單株抗體標示過氧化氫酶 48-3.2.4 最佳化rHA1-bELISA條件 49-3.2.5 血清樣本 49-3.2.6 rHA1-bELISA操作流程 49-3.2.7 A450值轉換成血清抑制百分比 50-3.2.8 rHA1-bELISA之cut-off值、敏感性、特異性與一致性分析 50-3.2.9 15種HA亞型的高免血清之交叉反應分析 50-3.2.10 比較HI test與rHA1-bELISA之H6抗體監測能力 50四節 發展檢測H6亞型抗原之抗原捕捉型ELISA (AC-ELISA) 51-4.1 最佳化AC-ELISA條件 51-4.2 抗原製備 51-4.2.1 雞隻氣管樣本收集 51-4.2.2 雞隻氣管乳劑製備 51-4.2.3 病毒RNA萃取 52-4.2.4 H6 subtyping RT-PCR及洋菜膠體電泳 52-4.3 AC-ELISA之操作流程 52-4.4 AC-ELISA之cut-off值分析 53-4.5 AC-ELISA之特異性分析 53-4.6 AC-ELISA之靈敏度分析 53-4.7 比較H6 subtyping RT-PCR與AC-ELISA之靈敏度 53-4.8 以AC-ELISA檢測陽性之H6 subtyping RT-PCR氣管樣本 54四章 結果 55一節 病毒製備 55-1.1 病毒定量 55-1.1.1 血球凝集試驗及EID50測定 55-1.1.2 病毒核酸檢測 55-1.2 病毒純化與蛋白質定量 55二節 單株抗體製備 56-2.1 篩選及純化 56-2.2 單株抗體分析 56-2.2.1 Isotype分析 56-2.2.2 免疫墨點法 56-2.2.3 SDS-PAGE及西方墨點法 56-2.2.4 HI test 57-2.2.5 蛋白質定量 57-2.2.6 間接型ELISA 57三節 發展檢測H6亞型抗體之阻斷型ELISA 58-3.1 發展塗鍍全病毒的virus-bELISA 58-3.1.1 最佳化virus-bELISA條件 58-3.1.2 virus-bELISA之cut-off值分析 58-3.1.3 virus-bELISA之敏感性、特異性與一致性分析 58-3.1.4 15種HA亞型的高免血清之交叉反應分析 59-3.1.5 比較HI test與virus-bELISA之H6抗體監測能力 59-3.1.6 應用virus-bELISA於田間血清檢測 59-3.2 塗鍍HA1重組蛋白質的rHA1-bELISA 60-3.2.1 病毒HA1基因選殖 60-3.2.2 重組蛋白質之表現與純化 60-3.2.3 重組蛋白質之分析 61-3.2.4 最佳化rHA1-bELISA條件 62-3.2.5 rHA1-bELISA之cut-off值分析 63-3.2.6 rHA1-bELISA之敏感性、特異性與一致性分析 63-3.2.7 15種HA亞型的高免血清之交叉反應分析 63-3.2.8 比較HI test與rHA1-bELISA之H6抗體監測能力 64四節 發展檢測H6亞型抗原之AC-ELISA 65-4.1 最佳化AC-ELISA條件 65-4.2 抗原製備 65-4.3 AC-ELISA之cut-off值分析 65-4.4 AC-ELISA之特異性分析 66-4.5 AC-ELISA之靈敏度分析 66-4.6 比較H6 subtyping RT-PCR與AC-ELISA之靈敏度 66-4.7 以AC-ELISA檢測陽性之H6 subtyping RT-PCR氣管樣本 66五章 討論 68一節 塗鍍全病毒的阻斷型ELISA (virus-bELISA) 68二節 塗鍍HA1重組蛋白質的阻斷型ELISA (rHA1-bELISA) 72三節 抗原捕捉型ELISA (AC-ELISA) 74考文獻 77amp;#8195;application/pdf1744152 bytesapplication/pdfen-US家禽流行性感冒病毒H6亞型抗體單株抗體阻斷型酵素連結免疫吸附法抗原捕捉型酵素連結免疫吸附法avian influenza virusH6 subtype antibodymonoclonal antibodyblocking enzyme-linked immunosorbent assayantigen-capture enzyme-linked immunosorbent assaythesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/178937/1/ntu-98-R96629007-1.pdf