張震東臺灣大學：生化科學研究所張寧琄Chang, Ning-ChuanNing-ChuanChang2007-11-262018-07-062007-11-262018-07-062007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/52821TGase（transglutaminase）最早是由Heinrich Waelsch於1957年所發現，是一個在有鈣離子存在的情形下，能對蛋白質的Gln residue上γ-carboxamide group與Lys residue上ε-amino group進行交聯作用（cross-linking）的一個酵素。目前有九種的TGase家族基因已被證實，而其中有八種都可表現為具有活性的酵素。 睪丸是男性的生殖和內分泌系統的器官之一，主要的功能是提供精蟲形成（spermatogenesis）和分泌男性賀爾蒙，像是大家較為熟悉的睪丸素（testosterone）。一般精蟲形成所需的時間約為70天，從青少年時期開始，一直到死，雖然隨著年齡的增長，spermatogenesis的情形會略為下降，但還是持續的進行中。 在本實驗中，我們利用小鼠的睪丸為材料，以蛋白質體學的方法去純化以及鑑定小鼠睪丸內TGase的受質，希望在一個像睪丸這樣持續進行細胞生長與分化的組織裡，了解TGase所扮演的角色為何。經由純化及MS/MS鑑定過後，我們發現了數十種蛋白質在小鼠睪丸內可能為TGase的受質，在經由重組TGase受質蛋白的體外 transamidation反應以及TGase 受質 pull-down的immunoblotting assay，我們也證實了這些蛋白在體外的確為TGase的受質。 未來我們希望從中選取了幾個可能為TGase受質的蛋白，觀察其TGase進行transamidation過後，會對這些蛋白的酵素活性、蛋白與蛋白之間的作用力或是protein translocation會有怎樣的影響，進而能更加了解TGase在睪丸內的角色與功能。TGase (Transglutaminase) was first discovered by Heinrich Waelsch in 1957. It is a calcium-dependent enzyme, which catalyzes the formation of isopeptide linkages between the γ-carboxamide group of a glutamine residue and the ε-amino group of a lysine residue. Some physiological roles are demonstrated for TGase, including blood coagulation, regulation of cell growth and differentiation, and programmed cell death. Testis is a component of both the reproductive system and the endocrine system. The respective functions of the testis are: producing sperm (spermatozoa) and producing male sex hormones, of which testosterone is the best known . The process of spermatogenesis takes approximately 70 days, it starts at puberty and usually continues uninterruptedly until death, although a slight decrease in the quantity of produced sperm can be discerned with increase in age. In this research, we adopted proteomics methods to purify and identify TGase substrates. After MS/MS analysis, we have identified over 70 potential TGase substrates, some of them have been verified in our lab by in vitro transamidation of recombinant TGase substrates and/or by immunoblotting of TGase substrates in a pull-down assay. More importantly, most of the identified TGase substrates are novel and have not yet been studied. Our future work will be to examine the effects of transamidation on the feature of each novel substrate, in terms of enzyme activity, protein-protein interaction, and protein translocation.目錄I 中文摘要III 英文摘要IV 第一章 第一節 精蟲形成（Spermatogenesis) 1 第二節 Transglutaminase的介紹與功能 4 第三節 蛋白質質譜分析與鑑定 7 第四節 TGase substrates的鑑定 7 第五節 表現蛋白 8 第二章 材料與實驗方法 第一節 實驗動物 9 第二節 SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳 （SDS-PAGE） 9 第三節 蛋白質膠片染色 (Coomassie blue G-250 staining) 10 第四節 銀染色法（Silver staining） 10 第五節 西方轉印法（Western Blotting）11 第六節 小鼠睪丸內蛋白的萃取 11 第七節 小鼠睪丸內蛋白之純化 12 第八節 In vitro transamidation assay 12 第九節 Biotin-labeled蛋白純化 12 第十節 Biotin overlay assay 13 第十一節 小白鼠組織全部核糖核酸的製備 13 第十二節 製備第一股去氧核糖核酸（cDNA） 13 第十三節 核酸引子的設計與合成 14 第十四節 聚合酶連鎖反應（PCR） 15 第十五節 核酸的接合作用(Ligation)及轉化作用(Transformation) 15 第十六節 質體DNA的製備（Minipreparation of plasmid DNA） 16 第十七節 第二次聚合酶連鎖反應及限制酶反應16 第十八節 基因表現與純化重組蛋白 16 第十九節 多株抗體血清製備（Polyclonal anti-serum preparation） 17 第二十節 小鼠睪丸內microtubules的製備 17 第三章 結果 第一節 小鼠睪丸蛋白的純化 19 第二節 蛋白質質譜鑑定結果 19 第三節 TGase substrates之部分基因表現策略 20 第四節 TGase substrates之抗體製備與辨識 21 第五節 小鼠睪丸內microtubules的製備 21 第六節 nudC可能的結合蛋白分析 22 第四章 討論 第一節 可能TGase substrates的純化策略 23 第二節 蛋白質質譜儀分析之樣本選擇及處理 23 第三節 TGase substrates與testis功能之探討 24 第四節 TGase對nudC可能的作用與影響 25 第五節 Q donor以及K donor蛋白受質的特異性 26 第六節 結語與未來研究方向 26 參考文獻 28 圖表 321635169 bytesapplication/pdfen-US轉麩胺醯胺脢睪丸TransglutaminaseTestisotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/52821/1/ntu-96-R94b46013-1.pdf