指導教授：徐善慧臺灣大學：高分子科學與工程學研究所蔡孟釗Tsai, Meng-ChaoMeng-ChaoTsai2014-11-282018-06-292014-11-282018-06-292014http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/262680近期高分子產業趨勢之一為發展環保綠色製程或是可降解產品，而綠色製程之生物可降解高分子作為生醫材料或組織工程支架其需求更甚。本研究以水性製程合成生物可降解聚胺酯(polyurethane, PU)，並形成奈米分散液，成分中的軟鏈段使用兩種聚酯二元醇，分別為poly(ɛ-caprolactone) diol和poly(ethylene-co-butylene adipate) diol，再以冷凍乾燥製備成三維海綿狀多孔支架。PU支架製備後進行其結構鑑定、潤濕性、機械性質、降解行為與降解產物分析，並探討支架孔洞結構對機械性質之影響與不同體外降解環境之降解機制分析。將軟骨細胞植入支架，並置於靜態或動態條件下培養，進行軟骨細胞外基質分泌與人類骨髓幹細胞(MSCs)基因表現分析。得本研究合成之PU奈米粒粒徑為約於40 nm，獲得的PU支架不僅具有良孔洞連通性，且其孔洞結構為螺旋形態。支架之親水性佳，且具有高的孔隙率和吸水率。在機械性質方面，除PU之固有彈性外，其螺旋型孔洞結構亦是支架拉伸與壓縮性質佳之主因。PU支架之動態機械性質無論是於乾燥或是濕潤之狀態下，其儲存模數值皆隨頻率增加而上升，顯現其彈性特質。PU支架在37℃磷酸鹽緩衝液中之降解速率較在木瓜蛋白酶消化液和去離子水顯著。由支架降解產物分析推測降解過程先進行膨潤，再進一步酯基水解，且細胞毒性不顯著。而PU支架之收縮情形可由二次冷乾的方法改善。在體外軟骨細胞生長測試中，軟骨細胞於靜態中PU支架較PLA支架內分布均勻，PLA細胞大部分分布於表層中；細胞在動態環境下培養7日之生長較靜態佳。於動態環境培養下，細胞外基質會部分流失至培養液中，而PU支架較PLA支架內細胞外基質分泌量稍高，且細胞於PU支架分布均勻，可能為其GAG保留於細胞中含量較高之原因之一。而支架MSCs以軟骨分化液培養七日，PU支架軟骨基因表現較PLA支架佳。綜合以上之優勢，PU支架有應用於軟骨組織工程發展之潛力。Biodegradable polyurethane (PU) was synthesized by a green and sustainable water-based process. The process rendered homogenous PU nanoparticles (NPs). Spongy PU scaffolds in large dimension were obtained by freeze-drying the PU NP dispersion. The spongy scaffolds were examined in terms of the porous structure, wettability, mechanical properties, degradation behavior, and degradation products. The capacity as cartilage tissue engineering scaffolds was evaluated by growing chondrocytes and mesenchymal stem cells (MSCs) in the scaffolds. Scaffolds made from PU dispersion had excellent hydrophilicity. The scaffolds had high porosity and water absorption. Examination by micro-computed tomography confirmed that PU scaffolds had good pore interconnectivity. The degradation rate of the scaffolds immersed in phosphate buffered saline was much faster than that in papain solution or in deionized water at 37 oC. The biodegradable PU appeared to be degraded via the cleavage of ester linkage, judging from the degradation products. The intrinsic elastic property of PU and the gyroid-shape porous structure of the scaffolds may have accounted for the outstanding strain recovery (87 %) and elongation behavior (257 %) of the PU scaffolds, compared to conventional poly(D,L-lactide) (PLA) scaffolds. Chondrocytes were effectively seeded in PU scaffolds without pre-wetting. They grew better and secreted more glycosaminoglycan in PU scaffolds vs. PLA scaffolds. Human MSCs showed greater chondrogenic gene expression in PU scaffolds than in PLA scaffolds after induction. Based on the favorable hydrophilicity, elasticity, and regeneration capacities, the novel biodegradable PU scaffolds may be superior to the conventional biodegradable scaffolds in cartilage tissue engineering applications.誌謝 I 摘要 II ABSTRACT III 目錄 V 圖目錄 IX 表目錄 XII 第一章、文獻回顧 1 1.1. 組織工程支架構築原料發展統整 1 1.1.1.聚胺酯 1 1.1.2. Polyurethanes (PU)與生醫材料發展 3 1.1.3. 高分子奈米、微米顆粒製備與應用 6 1.1.4. 水性生物可降解聚胺酯(waterborne biodegradable polyurethane, WDPU)乳液 6 1.1.5. WDPU離子體(ionomer)於生醫領域之應用 7 1.1.6. 應用於組織工程支架之天然與合成生物可降解高分子 7 1.2. 生物可分解PU彈性體與PLA塑膠 8 1.2.1. 生物可降解PU彈性體簡介 8 1.2.2. 生物可降解PU彈性體降解機制 8 1.2.3. PU降解速率影響因素 9 1.2.4. 生物可降解PU彈性體降解產物體內實驗毒性概述 10 1.2.5. 生物可降解塑膠與降解機制簡介 11 1.2.6. 生物可降解與不可降解材料體內實驗比較 12 1.3. 組織工程支架與加工技術 13 1.3.1. 組織工程 13 1.3.2. 高分子材料工程與組織工程 14 1.3.3. 組織工程支架加工技術概念 15 1.3.4. 溫度相轉換技術原理與支架加工之應用 16 1.3.5. 組織工程支架機械性質 17 1.4. 軟骨組織工程 18 1.4.1. 不同孔洞特性組織工程支架細胞生長微環境之研究 19 1.4.2. 生物反應器與組織工程 20 1.4.3. 不同團隊間軟骨組織工程之發展 21 1.5. 研究動機 24 第二章 研究方法 25 2.1. 研究架構 25 2.2. 水性生物可降解聚胺酯(waterborne biodegradable polyurethane, WDPU) 27 2.2.1. WDPU基本原料與配方設計 27 2.2.2. WDPU乳液製備 29 2.3. WDPU乳液基本物性鑑定 31 2.3.1. WDPU乳液粒徑分析 31 2.3.2. 穿透式電子顯微鏡（transmission electron microscope, TEM）觀測 31 2.4. WDPU與Polylactide (PLA)膜基本材料物性鑑定 32 2.4.1. WDPU與PLA膜製備 32 2.4.2. 親疏水性與膨潤行為分析 32 2.4.3. 拉伸試驗 33 2.4.4. 絕對密度(absolute density)分析 33 2.4.5. 膠體滲透層析儀(gel permeation chromatography, GPC) 36 2.4.6. 衰減全反射傅立葉紅外光譜儀 36 2.5. 多孔支架加工 37 2.5.1. 製程一:直接冷凍乾燥法 37 2.5.2. 製程二:粒子粒濾法(particle-leaching method) 37 2.6. 多孔支架之物性分析 40 2.6.1. 支架孔隙率、吸水率與潤濕能力(wetability)分析 40 2.6.2. 支架孔洞結構與尺寸分析 40 2.6.3. 動態彈性機械分析儀 (dynamic mechanical analyzer, DMA)檢測 41 2.6.4. 支架拉升與壓縮回復力 41 2.7. 體外降解實驗 41 2.7.1. WDPU與PLA支架降解 41 2.7.2. 一維質子核磁共振與傅立葉紅外光譜儀檢測 42 2.7.3. 降解產物毒性測試 42 2.8. 組織工程實驗 47 2.8.1. WDPU支架之UV-vis與PL 光譜背景值 47 2.8.2. 支架滅菌、空白支架培養與細胞培養 47 2.8.3. 細胞增生與細胞植覆 50 2.8.4. 生物反應器培養 52 2.8.5. 葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAG)定量分析 52 2.8.6. 人類骨髓間葉幹細胞軟骨化基因表現分析 52 2.9. 統計分析 53 第三章 實驗結果 57 3.1. 水性生物可降解聚胺酯合成 57 3.2. WDPU乳液基本物性鑑定 57 3.3. WDPU膜基本材料物性鑑定 57 3.4. 多孔支架之物性分析 58 3.4.1. 不同固含量WDPU支架孔洞結構分析 58 3.4.2. 直接冷凍乾燥法與粒子瀝濾法WDPU與PLA支架加工與孔洞分析 58 3.4.3. 支架孔隙率、吸水率與潤濕能力(wettability)分析 59 3.4.4. 支架機械性質分析 59 3.5. 支架體外降解實驗 61 3.5.1. WDPU與PLA支架於不同溶液下之降解結果 61 3.5.2. WDPU支架於磷酸緩衝溶液與鹽類溶液降解機制分析 61 3.5.3. PU、PLA膜與支架於木瓜分解酵素溶液體外降解實驗 62 3.6. 支架降解產物分析 63 3.6.1. 一維質子核磁共振檢測 63 3.6.2. 傅立葉紅外光譜儀分析 63 3.6.3. 降解產物細胞毒性 64 3.7. 支架中之三度空間細胞培養 65 3.7.1. 細胞增生與細胞植覆 65 3.7.3. PU與PLA支架於靜態、動態環境下培養軟骨細胞與GAG定量分析 65 3.7.4. PU與PLA支架之切片與細胞基質觀察 66 3.7.5. PU與PLA支架MSCs軟骨誘導分化基因表現(由實驗室學長協助完成) 66 第四章 討論 67 4.1. 水性生物可降解聚胺酯合成 67 4.2. PU乳液基本物性鑑定 67 4.3. PU與Polylactide (PLA)膜基本材料物性鑑定 68 4.4. 多孔支架之物性分析 68 4.4.1. PU與PLA支架加工 68 4.4.2. 支架孔隙率、吸水率與潤濕能力(wetability)分析 69 4.4.3. 支架機械性質分析 69 4.5. 支架體外降解實驗 70 4.6. 支架降解產物分析 72 4.7. 支架中之三度空間細胞培養 72 第五章 結論與未來展望 74 參考文獻 1036669562 bytesapplication/pdf論文公開時間：2016/07/09論文使用權限：同意有償授權(權利金給回饋學校)水性生物可降解聚胺酯支架降解彈性軟骨thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/262680/1/ntu-103-R01549009-1.pdf