蔡偉博臺灣大學：化學工程學研究所王閔正Wang, Min-ChengMin-ChengWang2007-11-262018-06-282007-11-262018-06-282004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/52334本研究為針對抗生物素與生物素的鍵結系統，應用於膝關節軟骨細胞在2-D表面(TCPS和可分解高分子)的貼附與生長之研究。在本研究中提供了一種有效且方便的系統，來增加軟骨細胞的貼附量。研究中利用3-sulfo-NHS-biotn與細胞膜上蛋白質的NH2官能基形成醯胺鍵(amide bond)，可於細胞膜表面接上生物素，形成生物素化細胞，再於料表面吸附抗生物素分子，兩者作結合就可使此系統運用於軟骨細胞的貼附。研究結果顯示，此系統可增加一開始軟骨細胞附著的數量，並在短時間內使細胞攤平，於基因表現上還具有軟骨細胞的特性。 本研究更進一步的對於PLGA材料表面，將此系統配合，幫助細胞附著的蛋白質fibronectin混和使用。結果顯示利用混和系統的生物素化細胞，不但有快速貼附與攤平的效果，而且於七天的培養下細胞數目明顯的比正常細胞只運用幫助細胞附著的蛋白質fibronectin來的多。同樣的在基因表現方面上還保有軟骨細胞的性質。本研究成功的將此鍵結系統，運用於增加關節軟骨細胞於TCPS表面和可分解高分子表面的貼附與生長。此結果可以進一步的運用於3-D生物可生解鷹架的培養上，對於軟骨組織工程將更有應用的潛力與價值。Cell adhesion to synthetic biomaterials is a prerequisite for anchorage cell culture and tissue engineering. The current study investigated the utilization of the avidin-biotin binding system in enhancing chondrocyte adhesion to tissue culture polystyrene (TCPS) and biodegradable polymer surface. Porcine chondrocytes were biotinylated by using 3-Sulfo-NHS-Biotin, and avidin was immobilized onto material surface by adsorption. In this study, we revealed that avidin-biotin system can enhance initial chondrocytes adhesion and spread out in a short time. The progeny of biotinylated chondrocytes still maintained the ability of expressing cartilage extracellular matrix proteins, such as type II collagen and aggrecan. Otherwise, we also used avidin-biotin system with fibronectin on PLGA surface. Contrast with using combine system and single system, combine system can enhance cell adhesion than avidin-biotin system and fibronectin system. After seven days culture, the progeny of these cell still maintain the ability of expressing cartilage extracellular matrix proteins. These results indicate that the avidin-biotin binding system could therefore help in the area of cell culture and tissue engineering.誌謝……………………………………………………………………Ⅰ 中文摘要………………………………………………………………Ⅱ 英文摘要………………………………………………………………Ⅲ 目錄……………………………………………………………………Ⅳ 圖目錄…………………………………………………………………Ⅸ 表目錄……………………………………...…………………….ⅩII 縮寫與符號說明………………………………………………...ⅩIII 中英名詞對照…………………………………………………..…ⅩⅣ 第一章緒論 1.1細胞貼附對生醫工程的響………………………………………...1 1.2組織程……………………………………………………………...2 1.2.1組織工程的方法…………………………………………….…..3 1.3細胞附……………………………………………………………...7 1.3.1細胞貼附的機制………………………………………………7 1.3.2增加細胞貼附的方式…………………………………………8 1.3.2.1材料表面的改善…………………………………………….8 1.3.2.2增加細胞膜上可使用的官能基…………………………....9 1.4生物素與抗生素………………………………………………….11 1.4.1 抗生物素-生物素統………………………………………...13 1.5實驗目的……………………………………………………………15 第二章材料與方法 2.1實驗藥品與器…………………………………………………….16 2.1.1組織分解與細胞培養溶液……………………………………..16 2.1.2細胞生物素化…………………………………………………..18 2.1.3細胞計數………………………………………………………..18 2.1.4固定細胞及染色……………………………………………….19 2.1.5高分子溶液……………………………………………………..19 2.1.6 RT-PCR…………………………………………………………20 2.1.7細胞培養器材與實驗器材……………………………………..20 2.1.8統系與分析軟體………………………………………………..22 2.2實驗步驟………………………………………………………….22 2.2.1細胞培養………………………………………………………..22 2.2.2細胞數量分析…………………………………………………..23 2.2.3細胞表面接上生物素…………………………………………..23 2.2.3.1細胞膜表面生物素分子數量測試………………………..24 2.2.4材料表面高分子塗佈…………………………………………..25 2.2.5材料表面吸附抗生物素………………………………………..25 2.2.5.1材料表面抗生物素吸附量測試……………..……………26 2.2.6材料表面吸附抗生物素與fibronectin………………………26 2.2.7細胞觀察與拍照………………………………………………..27 2.2.7.1細胞固定與染色………………………….………………..27 2.2.7.2細胞使用PI與BCECF螢光染色………..………………27 2.2.8 RT-PCR………………………………………………….…...28 2.2.8.1萃取RNA…………………………………………………..28 2.2.8.2反轉錄(Reverse transcription；RT) ………………..…28 2.2.8.3 Polymerase chain reaction （PCR）……………………29 2.2.8.4 DNA電泳………………………………………………..30 2.3 12-well TCPS表面……………………………………………..31 2.3.1細胞短時間貼附………………………………….…………..31 2.3.2細胞在既定時間內於不同狀況下貼附比較………….………31 2.3.2.1抗生物素表面…………………………………….………..31 2.3.2.2抗生物素與fibronectin混和表面………………….….…32 2.3.3細胞生長與基因表現………………………………………...33 2.3.3.1抗生物素表面……………………………………………...33 2.3.3.2抗生物素與fibronectin混和表面……………….……..…33 2.4 96-well plate高分子材料表面………………………………..34 2.4.1細胞短時間貼附……………………………………...……..34 2.4.1.1 PDLLA與PLLA材料表面 ………………………………34 2.4.1.2 PLGA材料表面……………………………………….…..35 2.4.2細胞在既定時間內於不同狀況下貼附比較………………….36 2.4.2.1 PDLLA與PLLA材料表面 ………………………………36 2.4.2.2 PLGA材料表面……………………………………….…..36 2.4.3細胞生長與基因表現………………………………..………..37 2.4.3.1 PDLLA與PLLA材料表面 ………………………………37 2.4.3.2 PLGA材料表面……………………………………….…..38 第三章結果與討論 3.1利用抗生物素-生物素系統增加細胞貼附於TCPS………….……39 3.1.1軟骨細胞進行生物素化……………………………….……..41 3.1.2抗生物素吸附於TCPS表面…………………………………41 3.1.3抗生物素-生物素系統運用於TCPS材料上………….….…42 3.1.4生物素化細胞的生長與基因表現……………………………46 3.2利用抗生物素-生物素系統增加可分解高分子表面細胞貼附.…48 3.2.1聚乳酸(PLA，polylactic acid) …………………………….48 3.2.2乳酸/甘醇酸共聚高分子(PLGA，Poly(lactide-co-glycolide))49 3.2.3 抗生物素-生物素系統運用於可分解高分子表面………….50 3.3軟骨細胞於高分子膜表面之生長與基因表現…………………..53 第四章結論 4.1結論………………………………………………………………..55 附錄…………………………………………………………………..82 參考文獻……………………………………………………………..83 圖目錄 圖1.2.1：組織工程圖……………………………………………6 圖1.3.2.2-1：avdin-biotion system示意圖…………….………10 圖1.4-1：生物素分子式………………………………………………12 圖1.4-2：抗生物素單分子圖…………………………………………12 圖3.1.1：細胞生物素化示意圖………………………………………39 圖3.1.1-1：生物素化細胞與avidin-FITC反應……………………57 圖3.1.1-2：生物素化細胞培養一天後與avidin-FITC反應………58 圖3.1.1-3：生物素化細胞培養三天後與avidin-FITC反應……….59 圖3.1.2 ：Avidin-FITC於TCPS表面上的吸附曲線……………….60 圖3.1.3-2：第零代細胞短時間貼附…………………………………61 圖3.1.3-2：第一代細胞短時間貼附…………………………..….61 圖3.1.3-3：細胞貼附在TCPS表面1小時…………………..…….62 圖3.1.3-4：細胞貼附在TCPS表面4小時…………………………….63 圖3.1.3-5：細胞貼附在TCPS表面24小時………………………….64 圖3.1.3-6：細胞貼附於TCPS表面4小時後細胞面積分佈…………65 圖3.1.3-7：細胞貼附於TCPS表面24小時後細胞面積分佈…………65 圖3.1.3-8：第零代細胞貼附貼附於TCPS表面1小時………………66 圖3.1.3-9：第一代細胞貼附貼附於TCPS表面1小時………………66 圖3.1.3-10：第零代細胞使用trypsin-EDTA………………………67 圖3.1.3-11第一代細胞於無血清的環境中，比較使用fibronectin差異.......................................................67 圖3.1.4-1：第一代細胞於TCPS表面生長曲線………………………68 圖3.1.4-2：TCPS材料表面基因表現…………………………………69 圖3.1.4-3：細胞培養三天使用，碘化丙啶(Propidium iodide, PI)與BCECF染色……………………………………………………………70 圖3.1.5-31：比較avidin-biotin system與混和fibronectin之細胞生長圖..................................................71 圖3.2.1-1：第一代細胞於PDLLA表面貼附2小時……………………72 圖3.2.1-2：第一代細胞於PLLA表面貼附2小時……………………72 圖3.2.1-3：第一代細胞於PLGA表面貼附2小時……………………72 圖3.2.1-4：第一代細胞於PLGA表面貼附2小時……………………73 圖3.2.1-5：第一代細胞在有血清的環境下於PLGA表面短時間貼附73 圖3.2.1-6：第一代細胞於PDLLA表面短時間貼附…………………74 圖3.2.1-7：第一代細胞於PLLA表面短時間貼附……………………74 圖3.2.1-8：於有血清的環境下，細胞貼附於PLGA表面4小時後細胞面積分佈……………………………………………………75 圖3.2.1-9：於有血清的環境下，細胞貼附於PLGA表面24小時後細胞面積分佈………………………………………………………76 圖3.2.1-10：第一代細胞於PLGA表面使用Hemaoxylin染色……….77 圖3.3-1：第一代細胞於PDLLA表面培養……………………………78 圖3.3-2：PLGA表面生長七天基因表現………………………………79 圖3.3-3：第一代細胞於PDLLA表面培養……………………………80 圖3.3-4：第一代細胞於PLLA 表面培養……………………………80 表目錄 表一 細胞於TCPS材料表面附著4小時與24小時細胞面積平均…..81 表二 細胞於PLGA材料表面附著4小時與24小時細胞面積平均…...81817783 bytesapplication/pdfen-US膝關節軟骨細胞生物素與抗生物素系統avidin-biotin binding systemchondrocytethesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/52334/1/ntu-93-R91524075-1.pdf