林萬寅Lin , Wann-Yin臺灣大學:化學研究所方珣Fang, ShiunShiunFang2010-06-302018-07-102010-06-302018-07-102009U0001-2707200911153400http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/187522化學發光 (chemiluminescence) 為經由化學反應，產生光的現象。本研究利用流動注入分析系統 (flow injection analysis) 以及停止流光譜儀 (stopped-flow spectrometer) 探討luminol與還原劑的化學發光現象。Luminol在強鹼環境中化學發光極微弱，通常會使用催化劑與增強劑以增加化學發光訊號。本研究中，以金屬離子催化並使用還原劑誘導luminol的化學發光反應，在流動注入分析系統中，NH2OH可使luminol-Co(II)在鹼性環境產生化學發光，而N2H4則可增強NH2OH-luminol-Co(II) 化學發光並使訊號較為穩定。利用停止流光譜儀分析，Co(II)的催化可使 NH2OH-luminol在鹼性環境中的反應時間縮短且增強化學發光訊號。 流動注入分析系統中，探討 pH 值、反應物（luminol、Co(II)、NH2OH、N2H4）濃度與混合的方式等因素影響化學發光強度，並找出系統最佳化條件。本系統使用單管流路配置（流速設定在5 ml/min)，當pH = 13.0、[luminol] = 30 μM、[Co(II)] = 100 μM、[NH2OH] = 200 μM與[N2H4] = 500 μM 的條件下有最強的化學發光訊號且再現性佳 (n = 21， RSD = 1.1 %)。本系統中，將試劑除氧後化學發光訊號減弱20 %，表示此化學發光與溶氧有關。加入專一性消滅．O2-、1O2 和．OH的試劑都會使化學發光訊號降低，推測這些活性含氧物質與 luminol 作用導致化學發光的增強。此化學發光系統可應用於偵測能與活性含氧物質作用而抑制化學發光的物質，並針對每一種分析物進行抑制最佳化，可獲得更高的靈敏度。例如應用於偵測酚類化合物 hydroquinone、catechol 及 resorcinol，其偵測範圍分別為 2 ~ 400 nM、3 ~ 500 nM 及 0.3 ~ 10 μM，偵測極限分別為 1.05 nM、1.35 nM 及 0.10 μM。此方法具有簡便、快速以及靈敏度佳等優點。 利用停止流光譜儀偵測 luminol-NH2OH-Co(II)-OH- 系統的化學發光現象，並探討pH值、反應物（luminol、Co(II)、NH2OH）濃度對化學發光強度及時間的影響。在Co(II) 與 luminol 存在下，改變NH2OH濃度，當NH2OH濃度慢慢增加( 0 ~ 50 μM )化學發光強度增加且時間縮短，將濃度提高( 100~200 μM )可觀察到兩根peak 出現，若NH2OH濃度高於250 μM則只見短時間的peak，不同時間產生的化學發光現象主要與 NH2OH 濃度有關。在200 μM NH2OH條件下，改變Co(II) 濃度，當Co(II) 濃度增加，化學發光強度增加且時間縮短，其中又以時間長的peak 2 改變較為顯著，時間短的peak 1變化不明顯，添加EDTA 則結果相反，且當EDTA 濃度略高於Co(II) 時，化學發光消失。改變 luminol 濃度，當濃度增加( 0~30 μM ) 整體化學發光強度增加且peak 2 時間略為增加，若luminol 濃度高於35μM，化學發光強度則隨luminol 濃度提高而降低，且反應時間拉長，此時 peak 只剩下一根。改變pH 值，化學發光的強度隨pH 值增加而增強，且反應時間縮短。將試劑除氧後化學發光訊號減弱，其中peak 2 減弱程度明顯，表示此化學發光與溶氧有關。在luminol化學發光系統中，也測試金屬離子：Co(II)、Hg(II)、Zn(II)、Cr(III)、Fe(III)、Mg(II)、Cu(II)、Ni(II)、Mn(II) 對化學發光的影響，發現Co(II) 反應時間較短且化學發光效率較高，便於偵測，因此催化劑以Co(II) 為最佳選擇。加入專一性消滅．O2-、1O2 和OH．的試劑，其中，消滅．O2-和．OH的試劑會使化學發光訊號降低，對此系統影響較大，而消滅1O2 的試劑則使化學發光增強，．O2-和．OH可能與luminol作用導致化學發光的增強。luminol-NH2OH-Co(II)-OH- 系統中，推測peak 2的化學發光是因luminol、Co(II)、NH2OH等試劑形成錯合物而造成的，若改變Co(II) 在溶液中的量，則直接影響化學發光強度及時間。另外，推測 peak 1的化學發光主要是溶氧與試劑產生的活性含氧物質所引起的。此系統應用於檢測酚類化合物，在不同實驗條件下，當溶液中存在 hydroquinone以及catechol時，不同的抗氧化劑分子具有不同的反應活性，可提升對酚類化合物的選擇性及靈敏度，增加定性及定量上的應用。Chemiluminescence (CL) is the emission of light from an electronic excited state of a species produced in a chemical reaction. In this study, the CL reaction of luminol with reducing agents and metal ions was studied by flow injection analysis and stopped-flow spectrometry. Upon addition of hydroxylamine to the luminol-Co(II) system, the CL intensity increased significantly. The use of hydrazine could further increase the CL intensity by five folds. The presence of Co(II) increased the CL intensity and reduced the CL duration. The effects of pH, concentration of reagents (luminol, Co(II), NH2OH, N2H4) and modes of reagent mixing on CL intensity were also investigated and optimized. The optimal conditions for maximum CL intensity are: flow rate = 5 mL/min, pH = 13.0, [luminol] = 30 μM, [Co(II)] = 100 μM, [NH2OH] = 200 μM and [N2H4] = 500 μM. The CL signal showed good reproducibility (RSD = 1.1% for n = 21). Deoxydenation of sample solutions by purging with nitrogen reduced the CL intensity by 20%, indicating that oxygen is involved in this CL reaction. Specific scavengers for ．O2- , 1O2 and ．OH decreased the CL intensity greatly, suggesting that these reactive oxygen species (ROS) played significant roles in the CL reaction. The CL detection system can be used to determine substance such as phenolic compounds that can effectively destruct ROS. For the determination of hydroquinone, catechol, and resorcinol, the dynamic ranges are 2~400 nM, 3 ~ 500 nM, and 0.3 ~ 10 μM, respectively, and the limits of diction are 1.05 nM, 1.35 nM and 0.10 μM, respectively. The proposed CL method is simple, rapid, convenient and sensitive. In this study, we have used the stopped-flow technique to study the effect of pH, reagent concentration, ROS scavengers on the CL intensity and duration. When increasing amount of NH2OH (0-50 μM) was added to the Co(II)-luminol solutions at pH 13.0, progressive increase in CL intensity and decrease in CL duration were observed. Interestingly, two distinct CL peaks appeared at higher concentrations of NH2OH (100~200 μM) and then a single peak was present at 250 μM NH2OH. The presence of increasing amount of Co(II) in luminol-NH2OH solutions enhanced the CL intensity and reduced the CL duration progressively, especially for the second peak. The CL intensity increased rapidly as the concentration of luminol increased, reached a maximum at 30 μM, and then dropped considerably at higher concentrations. Changing the pH has a profound effect on the CL emission. Strong and shortened CL emission was observed at high pH. These results indicate that the peak shape and duration of CL emission can be controlled by appropriate adjustments of reagent concentrations. It is found that CL peaks obtained at different conditions responded differently to the analytes in terms of selectivity and sensitivity. o gain a deeper insight into the mechanism of CL emission, we have investigated the effect of EDTA, ROS-scavenging, and deoxygenation on the CL emission. The addition of EDTA reduced the CL intensity and prolonged the CL emission dramatically. No CL emission was observed when the added EDTA exceeds the amount of Co(II), suggesting that free Co(II) is essential for CL. Deoxygenation of sample solutions reduced the CL intensity considerably. The extent of reduction in CL intensity is greater for the second peak than for the first peak. Thus oxygen is important in CL enhancement. ROS-scavenging studies revealed that ．O2- and ．OH are critical for the CL enhancement since the presence of scavengers for these two radicals decreased the CL intensity dramatically. It is postulated that complexation of Co(II) with suitable ligands such as NH2OH, OH-, O2, or luminol anion may lead to the generation of ROS (e.g., ．O2-, ．OH) or other reactive intermediate. Subsequent reactions of these reactive species with luminol results in the strong enhancement in CL emission.目 錄文摘要……………………………………………………………….I文摘要..………………………………………………...… ….III錄……….....……………………………………...…………..VI圖目錄………….…………………………………….……………IX一章 緒論-1化學發光的簡介..………………………………..……………… 1-2化學發光原理…………………………………..………………… 3-3 luminol發光系統介紹…………………………………………… 7-4 luminol與cobalt(II)化學發光反應…………………………… 9-5自由基與活性含氧物質對化學發光的影響.……..…………… 11-6還原劑誘導luminol化學發光…………………………………… 13-7研究動機………………… ……………..……………………… 16二章 儀器介紹-1-1流動注入分析法簡介………………………………………... 17-1-2流動注入分析法-儀器原理…… 18 -1-3流動注入分析法-儀器介紹.....21 -2-1 停止流光譜儀工作原理..........26 -2-2 停止流光譜儀-儀器介紹......28 -3 其他實驗器材…………… 30 -4 實驗藥品 …………… 31 三章 結果與討論一節 流動注入分析系統-1-1 訊號再現性…………………………………………..…… 33-1-2 還原劑濃度對化學發光的影響……………….……….… 34-1-3 luminol濃度對化學發光的影響………..……………… 37-1-4 Co(II) 濃度對化學發光的影響…………………………… 40-1.5 pH 值對化學發光的影響……………….....………… 42-1-6 luminol-Co(II)-NH2OH-N2H4-OH- 系統除氧測試…..… 43-1-7 luminol-Co(II)-NH2OH-N2H4-OH- 添加EDTA………… 44-1-8 luminol-NH2OH-N2H4-OH- 其他金屬離子的影響……… 45-1-9 自由基消滅劑對化學發光的影響……………………..... 47-1-10 分析上的應用-抗氧化劑檢測… ……………...……… 49-1-10-1 抗氧化劑檢測-對苯二酚（hydroquinone）…....… 50-1-10-2 抗氧化劑檢測-鄰苯二酚 (catechol) .……………… 58-1-10-3 抗氧化劑檢測-間苯二酚 (resorcinol) ….….…… 60-1-11 分析上的應用-檢測真實樣品中所含hydroquinone…… 62二節 停止流光譜儀-2-1 NH2OH濃度對化學發光的影響…………………….....… 66-2-2 luminol濃度對化學發光的影響………….….....… 70-2-3-1 Co(II) 濃度對化學發光的影響……...………..... 73-2-3-2添加EDTA 對化學發光的影響…………..……....… 76-2-4 pH 值對化學發光的影響………………….…………… 79-2-5除氧的測試…………………....………………………… 81-2-6其他金屬離子的影響……………….....………...…… 83-2-7-1分析上的應用-抗氧化劑檢測 ……………………..… 85-2-7-2分析上的應用-抗氧化劑檢測-hydroquinone………… 87-2-7-3分析上的應用-抗氧化劑檢測-catechol……………. 89-2-8-1自由基消滅劑的檢測…………… .....…………… 91-2-8-2自由基消滅劑對化學發光的影響- glutathione…… 93-2-8-3自由基消滅劑對化學發光的影響-1,4-diazabicyclo[2,2,2] octane 95-2-8-4自由基消滅劑對化學發光的影響- sodium azide……96-2-8-5自由基消滅劑對化學發光的影響- methanol…………97四章 結論………………………..….....………………99五章 參考文獻……………………….....………………100圖目錄一 生物發光的發光機制………………………………………………………… 1二 化學發光的種類……………………………………………………………… 3三 發光強度對時間作圖………………………………………………………… 6四 luminol化學發光反應機制………………………………………………… 7五 luminol與․O2-作用之化學發光反應機制……..…………………………… 11六 氧氣形成活性含氧物質的概要圖形………………………………………… 12七 流動偵測槽樣式 (a) 石英玻璃槽 (b) 螺紋槽 (c) 螺旋槽 (d) 堆疊槽… 19八 注射閥樣品注入示意圖……..………………………………….………… 22九 注射閥樣品載入示意圖……..……………………………….…………… 22十 蠕動幫浦……..…………………………………..…………………………… 23十一 注射閥……..…………………………………..…………………………… 24十二 流動偵測槽……..…………………………...…………………………… 24十三 偵測器與處理器……..………………………………...………………… 25十四 雙管流路……..………………………….…..…………………………… 26十五 單管流路……..………………………….…..…………………………… 26十六 連續流動管裝置圖……..………………………………...……………… 27十七 停止流儀樣品混和裝置圖……..………………………………...…….… 28十八 單混式停止流光譜儀裝置圖……..……………………………………… 29十九 停止流光譜儀單混合示意圖……..……………………....……………… 29二十 停止流光譜儀單混合儀器裝置圖……..………….……...……………… 30二十一 停止流光譜儀偵測器及處理器……..………………………………… 30二十二 注射再現性……..………………………….…………...…………… 33二十三 N2H4濃度對化學發光的影響……..…………………...……………… 35二十四 NH2OH濃度對化學發光的影響……..……………………………….... 36二十五 luminol-Co(II)-NH2OH-N2H4全光譜……..…………………………… 37二十六 luminol 濃度對化學發光的影響……..……………………………..… 39二十七 Co(II) 濃度對化學發光的影響……..…………………………………… 41二十八 pH 值對化學發光的影響……………………………...………………… 42二十九 luminol-Co(II)-NH2OH-N2H4-OH- 系統除氧測試….…………………… 43三十 luminol-Co(II)-NH2OH-N2H4-OH- 添加EDTA……..………….………… 44三十一 其他金屬離子對化學發光的影響……..………………………………… 45三十二 錳離子對化學發光的影響……..………………………………………… 46三十三 自由基消滅劑對化學發光的影響……..………………………………… 48三十四 檢測之抗氧化劑結構式……..……………………….…………...……… 50三十五 0.5μM~5μM luminol 對添加0.1μM Hydroquinone的抑制比率……… 52amp;#22295;三十六 5 μM~20 μM Co(II) 對添加0.05 μM Hydroquinone的抑制比率….… 53三十七 1 μM~30 μM NH2OH對添加0.05 μM Hydroquinone的抑制比率…… 54三十八 1 μM~30 μM NH2OH對添加0.01 μM Hydroquinone的抑制比率…… 55三十九 pH 值對添加0.01 μM Hydroquinone的抑制比率…………………… 56四十 2~400 nM hydroquinone對化學發光的檢量線…………………………… 57四十一 0~500 nM catechol濃度對化學發光訊號強度的檢量線………………. 59四十二 0.3~10 μM resorcinol 加入後的訊號強度……………………………… 61四十三 真實樣品的化學發光訊號………………………………………..……… 63四十四 真實樣品中添加50 nM hydroquinone的抑制比率…………………… 64四十五 0~200 nM 地下水中Hydroquinone檢量線………………..……..…… 65四十六 NH2OH濃度對化學發光的影響……………………………….……… 68四十七 強鹼條件中luminol 可能的反應機制……………………..…….……… 69四十八 luminol濃度對化學發光的影響……………………..……………...…… 72四十九 Co(II) 濃度對化學發光的影響(200μM NH2OH) …………...…… 74五十 Co(II) 濃度對化學發光的影響(50μM NH2OH) …………………..… 75五十一 EDTA濃度對化學發光的影響………………………………………… 77五十二 Co(II) 與luminol 可能的反應機制…………………………………… 78五十三 pH 值對化學發光的影響……………………………………………… 80五十四 系統除氧的測試………………………………………………………… 82五十五 其他金屬離子的影響…………………………………………………… 84amp;#22295;五十六 不同抗氧化劑組合對化學發光的影響………………………………… 86五十七 hydroquinone 對化學發光的影響……………………………………… 88五十八 catechol 對化學發光的影響…………………………………………… 90amp;#22295;五十九 各種自由基消滅劑對化學發光的影響………………………………… 92amp;#22295;六十 glutathione對化學發光的影響…………………………………………… 94amp;#22295;六十一 1,4-diazabicyclo[2,2,2] octane對化學發光的影響……………………… 95amp;#22295;六十二 sodium azide對化學發光的影響……………………………………… 96amp;#22295;六十三 methanol 對化學發光的影響………………………………………… 983220173 bytesapplication/pdfen-US化學發光還原劑鈷離子酚類化合物luminolChemiluminescencereducing agentCo(II)phenolic compoundthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/187522/1/ntu-98-R96223147-1.pdf