胡哲明臺灣大學：生態學與演化生物學研究所黃佳茵Hwang, Chia-YingChia-YingHwang2007-11-262018-07-062007-11-262018-07-062004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/55120毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬植物(Clematis L.)是一泛世界性分佈的類群，約有300種。目前對於鐵線蓮屬之分類研究是將之劃分為7亞屬，而主要分類依據均為外部形態特徵，部分則是解剖學、花粉學的證據。台灣鐵線蓮屬之植物目前紀錄有21個分類群，其中包括16種2亞種3變種，分屬於Campanella、Clematis、Flammula、Tubulosa此4個亞屬。本研究針對葉綠體trnK/matK及nrITS 二基因區域進行PCR並定序，再以核苷酸序列排序，進行譜系分析，期以建立台灣鐵線蓮屬植物的演化樹，並了解其彼此間的親緣關係，並以之和傳統形態分類的結果做比較分析及探討。 除了分類尚不明確的毛果鐵線蓮外，將台灣20個鐵線蓮分類群均取得材料進行分析，並合併GenBank資料庫中32種日本鐵線蓮屬植物(其中有3種台灣亦有產)相同片段的DNA序列進行譜系分析，以毛茛科小白頭翁屬中鵝掌草(Anemone flaccida)作為比對的外群。利用PAUP*4.0b10等軟體進行高度簡約原理(maximum parsimony，MP)、鄰近連接法(neighbor joining，NJ)及貝葉氏導出式分析(Bayesian inference，BI)之譜系分析。結果雖然葉綠體trnK/matK及nrITS二資料矩陣間有顯著差異，但其重要分群組成仍相似。由各種譜系分析的結果歸納出Flammula亞屬位於譜系樹最基群的位置，而其他亞屬間的親緣關係未解，另外，由譜系樹來看，包含種類較多的亞屬Campenalla及Clematis均為側系群。由分子序列和以形態特徵所建構之譜系樹，所得到的親緣關係結果不盡相同，表示現行的鐵線蓮分類仍有再商榷的必要。至於呈現相當大的種內形態變異之串鼻龍(C. grata)中，在靠海邊及靠內陸的植群間，在檢視的二序列中存有些陵t異。因此可能需要更多且變異度更適合的分子序列進行分析，以期得到更完整可信的結果。The genus Clematis L. (Ranunculaceae) is widely distributed all over the world with about 300 species. They were divided into seven subgenera mainly according to morphologies as well as anatomical and palynological evidence. There are 21 taxa of Clematis recognized in Taiwan, which belong to four subgenera, i.e. Campanella, Clematis, Flammula and Tubulosa. In this thesis I used the sequences of nuclear ribosomal ITS (nrITS) region and chloroplast trnK/matK to infer the phylogenetic relationships among Taiwanese Clematis. The sequences were analyzed separately and in combination, and compared with the phylogeny based on morphological characters. All of the 20 taxa of Clematis in Taiwan were obtained and the sequences were determined successfully, excluding the uncertain species C. uncinata var. okinawensis. The final data set also includes 32 taxa of Clematis in Japan (sequences from GneBank, with three taxa also found in Taiwan). Using Anemone flaccida as outgroup, three separate analysis were employed: maximum parsimony, neighbor joining and Bayesian inference. Partition homogeneity test for trnK/matK and nrITS indicated that these two data sets contain significantly different signals. Nonetheless, since the major grouping between these two data sets are similar, we performed a combined data analysis for inferring phylogeny to access total evidence in that manner. Based on the phylogeny, subgenus Flammula is the basal clade, while the relationships of all the other subgenera are unresolved. Subgenus Campenalla and Clematis are shown to be paraphyletic groups. The phylogenies based on DNA sequences and morphology show certain level of incongruence, suggesting a re-examination at intra-genic level for the genus Clematis. C. grata, the most divergent taxa in terms of its morphology, showed certain degree of populational differentiation based on trnK/matK and nrITS sequence analysis. The populations close to ocean show several nucleotide differences from the inland populations, however a thorough survey is needed to draw unambiguous conclusion.表次…………………………………………………………………………………...iv 圖次…………………………………………………………………………………....v 中文摘要……………………………………………………………………………...vi 英文摘要……………………………………………………………………………..vii 壹. 前言………………………………………………………….……………………1 貳. 材料與方法……………………………………………………………………...12 一. 材料之樣本採集….…………………………………………………………..12 二. 實驗方法…………………………………………………………….………..12 1. Genomic DNA的萃取………………………………………….…………..12 2. 聚合酶連鎖反應及DNA序列之鑑定……………………...…….……….13 三. 譜系分析…………………… ………………………………………………..15 1. 高度簡約原理(maximum parsimony，MP)……………………………..…15 2. 鄰近連接法(neighbor joining，NJ)………………………………………..16 3. 貝葉氏導出式分析(Bayesian unference，BI) ……………………………16 參. 結果…………………………………………………………………….………..26 一. 序列資料分析….……………………………………………………………..26 二. 分開資料及合併資料矩陣之分析……………………………….…………..26 1. 葉綠體trnK/matK資料矩陣之分析……………………………..……….26 【1】高度簡約原理(maximum parsimony，MP)………………………..…26【2】鄰近連接法(neighbor joining，NJ)………………………………..…27 【3】貝葉氏導出式分析(Bayesian unference，BI)……………………..…28 2. 細胞核nrITS資料矩陣之分析…...………………………………………..29 【1】高度簡約原理(maximum parsimony，MP)………………..……..…29 【2】鄰近連接法(neighbor joining，NJ)…………………………..………30 【3】貝葉氏導出式分析(Bayesian unference，BI)……………………..…31 3. 葉綠體trnK/matK與細胞核nrITS合併資料矩陣之分析……………..…32 【1】高度簡約原理(maximum parsimony，MP)………………..……..…32 【2】鄰近連接法(neighbor joining，NJ)…………………………..………33 【3】貝葉氏導出式分析(Bayesian unference，BI)……………………..…34 三. 台灣產鐵線蓮之形態特徵分析……………………………….……………..34 1. 未加權算數平均對群法(UPGMA)………………….……..……..…...…35 2. 鄰近連接法(NJ)…………………………..………………………..……..35 3. 高度簡約原理(MP)……………………..………………………..……….35 四. 二基因間異質性分析………………………………………….……………..36 1. 區塊異質性分析(Partition homogeneity test)….……….……..…..…..…36 2. 葉綠體trnK/matK與細胞核nrITS二者所得譜系樹之K-H test…..…..36 五. 演化樹分析方法之異質性分析……………………………………………...36 1. 葉綠體trnK/matK序列之資料矩陣……………………..….……....……37 2. 細胞核nrITS序列之資料矩陣……….……………..……………….…..37 3. 葉綠體trnK/matK與細胞核nrITS合併序列之資料矩陣……….…..…37 4. 形態特徵之資料矩陣…………………………………………….………38 六. 形態與分子資料矩陣所得譜系樹之異質性分析…………………………...38 肆. 討論…………………………………………………………………….………..66 一. 分子譜系樹之分析….………………………………………………………..66 二. 鐵線蓮屬分子譜系樹之親緣關係探討………………………….…………..69 三. 台灣產鐵線蓮屬之親緣關係及特徵演化之探討…………………………...71 四. 台灣產串鼻龍之親緣關係探討………………………….…………………..71 伍. 結論…………………………………………………………………….………..77 陸. 參考文獻……………………………………………………………….………..78 附錄一台灣產鐵線蓮屬植物之檢索表………………………….………………….85附錄二 PCR的反應流程………………………………………………………….87附錄三 葉綠體trnK/matK之DNA序列資料矩陣…………………………...….…89 附錄四 細胞核nrITS之DNA序列資料矩陣…………………………………….107 表一 本論文所使用之鐵線蓮屬植物分類系統整理表…………………..………....8 表二 鐵線蓮屬植物之分類系統整理表…………………………………….……….9 表三 台灣產鐵線蓮屬植物分類系統整理表………………………………..……..10 表四 台灣產鐵線蓮屬植物之形態特徵資料矩陣表…………..…………………..19 表五 用於序列分析之台灣產鐵線蓮屬植物採集記錄………………..…………..21 表六 本論文所使用引子序列……..………………………………………………..22 表七 GenBank資料庫中32種日本鐵線蓮屬植物及外群之序列號碼整理表…...23 表八 區塊異質性分析………………………………..……………………………..39 表九 葉綠體trnK/matK及細胞核nrITS二資料矩陣間之差異顯著分析….….….40 表十 葉綠體trnK/matK序列之不同分析譜系樹間的差異顯著分析..……………42 表十一 細胞核nrITS序列之不同分析譜系樹間的差異顯著分析………………..43 表十二 trnK/matK與nrITS合併序列之不同分析譜系樹間的差異顯著分析……44 表十三 形態特徵之不同分析譜系樹間的差異顯著分析………..………………..45 表十四 形態與分子資料矩陣間之差異顯著分析……………………..…………..46 圖一 台灣產鐵線蓮屬植物之相關係數分析圖…………..………………………..11 圖二 葉綠體trnK/matK所使用的片段及PCR引子位置標示……..……………..24 圖三 細胞核nrITS所使用的片段及PCR引子位置標示……..……………….…..25 圖四 葉綠體trnK/matK利用MP建構之譜系樹.…………………………………..48 圖五 葉綠體trnK/matK利用NJ建構之譜系樹.…………………………………..50 圖六 葉綠體trnK/matK利用BI建構之譜系樹.…………………………………..52 圖七 細胞核nrITS利用MP建構之譜系樹.……………………………………….53 圖八 細胞核nrITS利用NJ建構之譜系樹.……………………………………….55 圖九 細胞核nrITS利用BI建構之譜系樹.……………………………………….57 圖十 葉綠體trnK/matK與nrITS合併利用MP建構之譜系樹.…………………..58 圖十一 葉綠體trnK/matK與nrITS合併利用NJ建構之譜系樹.…………………60 圖十二 葉綠體trnK/matK與nrITS合併利用BI建構之譜系樹.…………………62 圖十三 台灣產鐵線蓮屬植物形態特徵利用UPGMA建構之譜系樹.……………63 圖十四 台灣產鐵線蓮屬植物形態特徵利用NJ建構之譜系樹.………………….64 圖十五 台灣產鐵線蓮屬植物形態特徵利用MP建構之譜系樹.…………………65 圖十六 細胞核nrITS利用PAUPRat建構之譜系樹.………………………………73 圖十七 鐵線蓮屬依分子譜系分析結果對應之分類階層…………………...…….74 圖十八 鐵線蓮屬依分子譜系分析結果及對應之重要形態特徵…………..……..75 圖十九 鐵線蓮屬依形態特徵建構之譜系樹及對應之分類階層………..………..76793632 bytesapplication/pdfen-US鐵線蓮屬親緣關係系統分類Clematisphylogenyotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/55120/1/ntu-93-R91226015-1.pdf