鄭謙仁臺灣大學：獸醫學研究所胡金灝Hu, Chin-HaoChin-HaoHu2007-11-282018-07-092007-11-282018-07-092004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/60025中文摘要 本實驗主要目的在探討PCV2 感染豬隻所引發之組織球浸潤及多核巨 細胞形成等肉芽腫性病變之病理機制。首先以豬肺臟巨噬細胞及豬周邊血液單核細胞為研究材料，與PCV2 病毒於試管內模式下進行長時間的培養，觀察其型態學的改變，偵測上清液細胞激素如：interleukin (IL)-1β，IL-8 及IL-10 的表現量，並且監測感染後細胞之存活率。同時採取現場PCV2 感染之PMWS 豬隻的淋巴結，經由病理切片判讀後將病變分類以進行免疫化學染色，來偵測淋巴結中，interferon (IFN)-γ，IL-1β，IL-8 及IL-10 等細胞激素的表現情形；並以原位雜交法偵測病毒核酸反應，以比較病變、細胞激素表現量及分佈，與病毒核酸分佈三者之間的相互關係。 結果在試管內模式下，豬肺臟巨噬細胞及豬周邊血液單核細胞的上清液中可發現細胞激素IL-8 的大量表現，在豬肺臟巨噬細胞的上清液也發現IL-1β的表現量較實驗組略為增加。在長時間的培養下，同時發現PCV2 感染後，細胞存活率有下降的情形。在細胞激素免疫化學染色中，發現PMWS豬隻淋巴結內有大量IFN-γ與IL-1β之陽性訊號。比較四種病變包括組織球浸潤、嗜中性球浸潤、組織球與嗜中性球同時存在，和病變輕微淋巴結的細胞激素以及病毒核酸的分佈後，發現IFN-γ的陽性細胞與組織球浸潤的病變之分佈區域相近，皆在淋巴濾泡生發中心區與副皮質區域，組織球病變中PCV2 之病毒量也較高。IL-1β則與嗜中性球浸潤有位置相關性。但細胞激素的表現分佈似乎與病毒核酸的分佈並無空間相關性。在各種病變的細胞激素表現量之比較，發現組織球浸潤病變的IFN-γ的陽性細胞表現量較其他各組為高；嗜中性球浸潤病變之IL-1β的陽性表現量與其他各實驗組相較也呈顯著的增加。因此，PCV2 的感染可能造成IFN-γ分泌，進而誘發肉芽腫性反應的產生。The main purpose of this study was to investigate the pathogenesis between PCV2 infection and PMWS lesions, namely histiocytosis or granulomatous lesions. Alveolar macrophages (AM) and peripheral blood monocytes (PBM) were obtained from 5 to 10-week-old healthy pigs free of PCV2 and PRRSV infection. The AM and PBM were inoculated with PCV2 and the viability, infectious rate, and morphological changes were observed and recorded. The supernatants were collected and the cytokine profiles were examined using commercial ELISA kits. Meanwhile, paraffin-embedded lymphoid tissues of field PMWS cases, which were negative in PCR results of pseudorabies virus, PRRS virus, and classic swine fever virus, were collected and graded for different stages of granulomatous lymphadenitis. Serial sections were made and detected later by in situ hybridization for the distribution of PCV2 viral nucleic acid. Immunohistochemical stainings for several granulomatous lesion-related cytokines, such as IL-1β, IL-8, IL-10, and IFN-γ, were performed. The results revealed that AM and PBM produced high levels of IL-1β and IL-8 in response to PCV2 infection, compared with non-infected cells. The significant effect of PCV2 infection on these cells started at 24 hours post infection.. In the 192 hours of incubation, the decrease in viability of PAM and PBM were also noted. The results of immunohistochemistry staining for cytokines revealed high expression of IFN-γ and IL-1β in the lymph nodes of PMWS pigs, compared with the control SPF pigs. The expression of IFN-γ was strong in the lymph nodes accompanied with lesions of histiocytosis. The expression of IL 1-β was strong in the lymph nodes accompanied with lesions of granulocytic infiltration. The distribution of PCV2 seemed to have no correlation with the distribution of cytokine signals. However, the viral loadings were strong in lymph nodes with histiocytosis lesions. The immnunohistochemistry staining result of IL-8 revealed minimal to negative pattern compared with the results of in vitro system, while IL-10 results were both negative in the in vitro system and IHC. In conclusion, PCV2 infection might enhance IFN-γproduction and thus trigger the granulomatous reactions.中文摘要I 英文摘要II 目錄IV 圖次VII 第一章緒言1 第二章文獻探討3 第一節豬離乳後多系統性消耗性症候群3 一、PMWS 歷史背景及發生概況3 二、PMWS 臨床症狀與病理變化4 第二節第二型豬環狀病毒5 一、PCV2 的病毒特性5 二、標的細胞7 三、PCV2 在細胞及實驗接種豬之致病機制與免疫系統之影響9 第三節肉芽腫性反應12 一、緒言12 二、肉芽腫的形成機制13 第四節原位雜交19 一、緒言19 二、原位雜交於PCV2 偵測之應用19 第五節豬隻淋巴結構造21 第三章材料與方法22 第一節緒言22 第二節試管內感染模式23 一、試驗設計23 一、實驗材料25 （一）第二型豬環狀病毒25 （二）細胞培養液26 （三）細胞清洗液26 （四）豬肺臟巨噬細胞之採集26 （五）豬周邊血液單核球之分離純化27 三、實驗方法28 （一）第二型豬環狀病毒感作28 （二）以trypan blue 色素排除試驗進 行豬肺臟巨噬細胞與周邊血液單核球之存活率測試28 （三）豬肺臟巨噬細胞與周邊血液單核球之感染率測定29 （四）豬肺臟巨噬細胞與周邊血液單核球之型態學觀察29 （五）細胞培養上清液中細胞激素之表現測定30 （六）統計分析30 第三節組織病變模式31 一、實驗動物31 二、實驗設計31 三、PMWS 豬隻淋巴結病變分類32 四、原位雜交法33 （一）探針之製備33 （二）以原位雜交法偵測組織中PCV2 病毒核酸33 （三）病毒量的計算34 五、免疫化學染色法偵測細胞激素表現34 （一）使用抗體34 （二）免疫化學染色35 （三）免疫化學染色切片之判讀與陽性細胞數目之計算方式35 （四）統計分析36 第四章結果37 第一節試管內感染模式37 一、感染PCV2 之豬肺臟巨噬細胞與周邊血液單核球之存活率測定37 二、PCV2 對豬肺臟巨噬細胞與周邊血液單核球之感染率測定37 三、PCV2 感染豬肺臟巨噬細胞與周邊血液單核球之型態學觀察41 四、PCV2 感染細胞培養上清液中細胞激素表現之測定42 （一） Interleukin (IL) -1β蛋白質表現之測定42 （二） Interleukin (IL)-8 蛋白質表現之測定42 （三） Interleukin (IL)-10 蛋白質表現之測定43 第二節組織病變模式47 一、實驗動物背景及分組47 二、免疫化學染色法偵測細胞激素表現47 三、淋巴結病變與細胞激素之空間位置相關性48 四、淋巴結病變與細胞激素陽性細胞量之相關性48 五、原位雜交反應(ISH) 偵測PCV2病毒核酸49 六、病毒核酸反應與細胞激素之位置相關性50 七、病毒核酸反應與病變之相關性50 八、病毒核酸反應與細胞激素表現量之相關性50 第五章討論61 參考文獻74 附錄84 圖2.1 穿透式電子顯微鏡下之純化PCV2 顆粒6 圖2.2 PCV2 及PCV1 之ORFs 示意圖7 圖3.1 試管內模式實驗設計流程24 圖3.2 組織病變模式實驗設計流程32 圖4.1 (a, b, c) a. PCV2 感染豬肺臟巨噬細胞(PAM) 存活率 b. PCV2 感染豬肺臟巨噬細胞(PAM) 細胞總數38 c. PCV2 感染豬周邊血液單核球(PBM) 存活率39 圖4.2 PCV2 感染豬肺臟巨噬細胞(PAM) 免疫螢光染色40 圖4.3 (a, b) PCV2 感染豬肺臟巨噬細胞(PAM) 細胞退行性病變 a. 感染後72 小時41 b. 感染後144 小時41 圖4.4 (a, b) 豬肺臟巨噬細胞(PAM) (a) 與周邊血液單核球(PBM) (b) 感染PCV2 上清液中IL-1β表現情形44 圖4.5 (a, b) 豬肺臟巨噬細胞(PAM) (a) 與周邊血液單核球(PBM) (b) 感染PCV2 上清液中IL-8 表現45 圖4.6 (a, b) 豬肺臟巨噬細胞(PAM) (a) 與周邊血液單核球(PBM) (b) 感染PCV2 上清液中IL-1β表現46 圖4.7 (a, b, c, d) 細胞激素免疫化學染色陽性對照組 a. IFN-γ，b. IL-1β，c. IL-8，d. IL-10 51 圖4.8 (a, b, c, d) 細胞激素免疫化學染色於豬隻淋巴結 a. IFN-γ，b. IL-1β，c. IL-8，d. IL-10 52 圖4.9 豬隻淋巴結組織球浸潤病變(H group) 與 細胞激素分佈之比較53 圖4.10 豬隻淋巴結嗜中性球浸潤病變(G group) 與 細胞激素分佈之比較54 圖4.11 H&G group 豬隻淋巴結病變與細胞激素分佈55 圖4.12 N group 豬隻淋巴結與細胞激素分佈之比較56 圖4.13 免疫化學染色Interferon-γ 於各病變組表現情形之比較57 圖4.14 免疫化學染色Interleukin-1β於各病變組表現情形之比較57 圖4.15 免疫化學染色Interleukin-8 於各病變組表現情形之比較58 圖4.16 免疫化學染色Interleukin-10 於各病變組表現情形之比較 58 圖4.17 豬隻淋巴結PCV2 病毒核酸與細胞激素分佈之比較59 圖4.18 免疫化學染色Interleukin-10 於各病變組表現情形之比較 60970595 bytesapplication/pdfen-US肉芽腫性病變豬環狀病毒細胞激素grnulomatousPMWSPCV2cytokinethesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/60025/1/ntu-93-R91629002-1.pdf