蔡珊珊臺灣大學：植物科學研究所魏廷翔Wei, Ting-ShyangTing-ShyangWei2007-11-272018-07-062007-11-272018-07-062006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/57941本研究針對台灣地熱區進行嗜熱性微生物之研究。由採集的13座溫泉樣區液中，篩選出一群與嗜熱性細菌 Thermus 屬相似，可生長在70 oC 的黃色菌株。經由形態觀察，為革蘭氏陰性、細胞呈桿狀、不具運動性、無內孢子。再經由細菌 16S rDNA 片段的擴增與序列比對，發現部分菌株的 16S rDNA 序列與國外已發表之 Thermus 屬菌種的相似度高達 99 % 以上，再藉由基本生理測試及脂肪酸組成分析，將此群菌株分別歸屬於：T. aquaticus NTU-103；T. thermophilus NTU-1534及NTU-1651；T. oshimai NTU-58、NTU-63 及 NTU-88；T. brockianus NTU-9、NTU-153 及 NTU-154。 另一群菌株的 16S rDNA 片段序列與國外已發表之 Thermus 屬菌種的相似度介於 96 至 98 % 之間，且DNA-DNA 雜合反應皆低於 70 %。由形態觀察、生理、生化及遺傳特性分析，可以將之歸為 Thermus 屬的新種菌株。與 T. thermophilus HB8 較相近的菌株NTU-56、NTU-62 及 NTU-158 被命名為 T. taipeiensis；與 T. scotoductus 較相近的菌株NTU-24 被命名為 T. wuraiensis；與T. brockianus 較相近的菌株NTU-559、NTU-1307 及 NTU-1597則尚未被命名。 目前國外命名且正式發表的 Thermus 屬菌種有 9 種，本研究發現台灣地熱區Thermus 屬菌株中包含4 種與國外發表的相同菌種以及3種本土新穎菌種 T. taipeiensis、T. wuariensis及未命名的 Thermus sp.，再加上本研究室之前已鑑定但未發表菌株 T. taiwanensis，可知台灣溫泉中的Thermus 屬菌相豐富且具有生物多樣性，並廣泛分布在台灣北部、中部及東部偏中性或是微鹼性溫泉中。This study focuses on thermophiles isolated from geothermal area in Taiwan. A group of thermophiles similar to genus Thermus which have been isolated from 13 hot springs in Taiwan. They form yellow pigmented colony and the cells of these organisms are Gram-negative, rod-shaped, non-motile, non-spore forming, and can grow at 70 oC. After 16S rDNA amplifications and sequence analyses, the blasting results indicate that these thermophiles can be divided into two groups. The 16S rDNA sequences of the first group isolates exhibit highest similarity value ( above 99 % ) to the related Thermus species. Based on physiological tests and fatty acid analyses, these thermophiles similar to Thermus species which have been named and published formally, are belonged to T. aquaticus NTU-103, T. thermophilus NTU-1534 and NTU-1651；T. oshimai NTU-58、NTU-63 and NTU-88；T. brockianus NTU-9、NTU-153 and NTU-154。 The 16S rDNA similarity of the other group of isolates are between 96% to 98% and DNA-DNA hybridizations are below 70 %. Based on physiological tests, fatty acid analyses, biochemical assays and genetics analyses, these thermophiles may be new species of genus Thermus. T. thermophilus HB8 related isolates NTU-56, NTU-62 and NTU-158 are named T. taipeiensis; T. scotoductus ITI-252 related Isolate NTU-24 is named T. wuariensis; another isolates NTU-559, NTU-1307 and NTU-1597 which are similar to T. brockainus YS038 have not been named. In this study, hundred strains of genus Thermus had been isolated and identified: four species of genus Thermus which are named and published formally are T. aquaticus, T. oshimai, T. brockianus and T. thermophilus, and three new species including T. taipeiensis, T. wuariensis and unnamed Thermus sp. are found in geothermal area of Taiwan. Besides, T. taiwanensis is one of new species of Thermus that is identified but not published formally. Thus, the genus Thermus exists in neutral or slightly alkaline hot springs in Taiwan and shows biodiversity.中文摘要............................................................................................................. i Abstract .............................................................................................................ii 縮寫對照表 .......................................................................................................iv 第一章 前言 1 1. 生物多樣性 1 2. 嗜熱性微生物 3 3. 嗜熱性細菌的應用…........……...…...…...…………………………….......5 4. 嗜熱菌屬…………………………………………………...………………...6 5.嗜熱菌屬的學術與應用價值……..................………………………………8 6. 台灣的地熱資源………………………………………………………..…..11 7. 台灣嗜熱性微生物之研究…………………………………………………12 8. 研究目標……………………………………………………………………14 第二章 研究材料與方法…………………………………………………………...15 實驗材料 1. 菌種…………………………………………………………………………15 2. 試劑與藥品…………………………………………………………………15 3. 儀器…………………………………………………………………………16 4. 培養基……………………………………...........................................…17 實驗方法 1. 樣本採集…………………………………………………………………..18 2. 嗜熱性菌株分離、純化……………………………………………………18 3. 嗜熱性菌株的保存…………………………………………………………19 細菌形態觀察、生理生化及遺傳特性分析………………………………………..20 4. 細菌之形態觀察 20 5. 細菌之生理特性 22 6. 脂肪酸組成分析…………………………………………………………... 26 7. 生化特性分析 26 8. 細菌之遺傳特性 30 第三章 研究結果………………………………………………………...…………40 1. 菌株的分離、篩選與純化………………………………………………….40 2. 16Sr DNA 片段序列分析………..……………………………………...…40 3. 形態觀察……………………………………………………………………42 4. 生理特性分析…………………………………………………………...….44 5. 脂肪酸組成分析…………………………………………………………..50 6. 生化特性分析……………………………………………………………..52 7. 遺傳特性分析……………………………………………………………..57 第四章 討論………………………………………………………………………...60 1. 嗜熱性細菌的分離與篩選………………...……………………………....60 2. Thermus 屬嗜熱菌的特性.................………………………………...….61 3.菌種之鑑定…………....................…………………………………………65 4. 台灣本土 Thermus 屬菌種之生物多樣性…………………………..…..67 第五章 參考文獻…………………………………………………………………...69 表格………………………………………………………………………………….88 表一、本實驗採集的溫泉樣區資料…………………………………………..88 表二、本實驗所使用的菌株材料……………………………………………..89 表三、所有分離菌株的 16S rDNA 片段序列比對結果……………………90 表四、新分離菌株的16S rDNA片段序列分析……………………………....91 表五、NTU-9、NTU-153、NTU-154、NTU-72、NTU-193、NTU-219、NTU-559、NTU-1307 及NTU-1597 與T. brockianus YS038 的形態觀察與基本生理特性………………………………………….…..92 表六、NTU-24、NTU-58、NTU-63、NTU-88及NTU-103與T. aquaticus TY-1、T. oshimai SPS-17 及 T.scotoductus ITI-252的形態觀察與基本生理特性…………………………………………….……………93 表七、NTU-56、NTU-62、NTU-158、NTU-1534 及 NTU-1651與T. thermophilus HB8的形態觀察與基本生理特性………………..….94 表八、NTU-72、NTU-193、NTU-219、NTU-559、NTU-1307及 NTU1597 與T. brockianus YS038 單一碳源的利用…………………………95 表九、NTU-24、NTU-56、NTU-62及 NTU158與T. thermophilus HB8 及 T. scotoductus ITI-252 單一碳源的利用……………………..……....96 表十、抗生素抗性分析………………………………………………………97 表十一、NTU-24、NTU-58、NTU-63、NTU-88 及NTU-103與 T. aquaticus YT-1、T. oshimai SPS-17 及T. scotoductusITI-252脂肪酸組成分析………………………………..…………………………………...98 表十二、分離菌株 NTU-56、NTU-62、NTU-158、NTU-1534及 NTU-1651與標準菌株 T. thermophilus HB8 脂肪酸組成分析………….....99 表十三、分離菌株 NTU-9、NTU-153、NTU-154、NTU-72、NTU-193、NTU-219、NTU-559、NTU-1307 及 NTU-1597與標準菌株T. brockianus YS038脂肪酸組成分析……………………………..100 表十四、生化特性分析………………………………………………………101 表十五、NTU-24、NTU-56、NTU-62及 NTU158 與T. thermophilus HB8 及 T. scotoductus ITI-252API-ZYM 酵素分析…………………102 表十六、NTU-72、NTU-193、NTU-219、NTU-559、NTU-1307及 NTU1597 與T. brockianus YS038 API-ZYM 酵素分析……………....…….103 表十七、DNA G+C 含量分析…………………………………………..….104 表十八、T. thermophilus HB8 與NTU-56、NTU-62 及 NTU-158的 DNA-DNA 雜合反應…………….................................………105 表十九、菌株T. brockianus YS038 與分離菌株NTU-72、NTU-193、NTU-219、NTU-559、NTU-1307 及 NTU-1597 的 DNA-DNA雜合反應……………...............................…......................……106 表二十，T. thermophilus HB8與NTU-56、NTU-62 及 NTU-158主要的生 理生化差異………………………………………………...………107 表二十一、T. brockianus YS038 與 NTU-72、NTU-193、NTU-219、 NTU-559、NTU-1307 及 NTU-1597 主要的生理生化差異…108 表二十二、T. scotoductus ITI-252 與 NTU-24 主要的生理生化差異…..109 圖…………………………………………………………………….………..110 圖一、單一菌落觀察………………………………………………………….110 圖二、革蘭氏染色…………………………………………………………….111 圖三、電子顯微鏡觀察…………………………………………………….....112 圖四、DNA-DNA 雜合反應…………………………………………………114 圖五、親緣演化關係圖………………………………….……………………115 圖六、台灣地熱區 Thermus 屬菌種的分布圖…………………………….116 附錄一……………………………………………………………………………...117 附錄二……………………………………………………………………………...118 附錄三……………………………………………………………………………...119 附錄四……………………………………………………………………………...120 附錄五……………………………………………………………………………...121 附錄六……………………………………………………………………………...122 附錄七……………………………………………………………………………...1241922731 bytesapplication/pdfen-US嗜熱菌生物多樣性臺灣地熱區ThermusbiodiversitygeothermalTaiwanotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/57941/1/ntu-95-R93b42006-1.pdf