蔡向榮臺灣大學：獸醫學研究所楊杰穎Yang, Chieh-YingChieh-YingYang2007-11-282018-07-092007-11-282018-07-092006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/60007鉤端螺旋體病（leptospirosis）是一個遍佈全球的人畜共通傳染病，鼠類是此菌重要的傳播宿主，其身上攜帶的鉤端螺旋體血清型往往與鄰近人類病患相關。本論文乃針對臺灣各主要港區、傳統市場、養雞場、校園與野地，於2005年6月至2006年5月，總計捕獲329隻鼠類，進行血清流行病學調查。以顯微凝集試驗檢測，1: 50為陽性抗體力價判定標準，抗體總陽性率為12.93% (41/317，95% CI = 11.05% – 14.82%)，其中馬祖福澳港的陽性率最高 (22.22%，2/9)，其次為高雄港區 (19.05%，16/84)；鼠種陽性率最高的是黃胸鼠 (18.18%，2/9)，其次是溝鼠 (15.72%，25/159)。陽性血清群方面，以Pomona最高 (64.29%，36/56)，Shermani次之 (12.50%，7/56)；幾何平均力價則是Autumnalis最高 (229.7倍)，其次是Pomona (181.6倍)。另外，為避免顯微凝集試驗需要操作活菌所構成的感染風險，減少操作時間、人工與材料成本，因此同時使用並評估以LipL32重組蛋白質為基礎的酵素連結免疫吸附法 (簡稱rLip32-ELISA)，和致敏非病原性菌體來源熱穩定抗原的乳膠凝集試驗，對鼠類血清進行檢測，期望能取代顯微凝集試驗，得到更簡便安全的檢驗方法。以顯微凝集試驗為黃金標準 (gold standard)，rLipL32-ELISA的敏感性為95.00 %，特異性為91.34 %，一致性為91.80 %，而乳膠凝集試驗的敏感性、特異性及一致性則分別為33.33%、87.80%與82.65%。與顯微凝集試驗比較後，兩者的kappa值分別為0.699 (95% CI= 0.59 – 0.81)及0.174 (95% CI = -0.27 – 0.62)。本研究發現臺灣鼠類的鉤端螺旋病血清抗體盛行率為12.93%，同時發現抗體陽性率最高的血清群為Pomona，與近年來的調查報告 (主要為Shermani)略有不同，需進一步研究調查以了解其情況。另外本研究發現rLipL32-ELISA的敏感性與特異性均高，一致性亦達到91.80%，故具有擔任鼠類鉤端螺旋體病血清抗體例行調查篩檢工具的潛力。Leptospirosis is one of the worldwide zoonoses. Rodent is the most important reservoir of leptospirosis, and their serovars are related to the ones of human patients. Hence the first part of this study is to investigate the leptospiral sero-prevalence in wild rodents captured during June 2005 and May 2006. Three hundred and twenty-nine rodents were captured from harbors, traditional markets, university campus and the fields in Taiwan. The total prevalence detected by MAT (microscopic agglutination test) was 12.93 % ( 41/317，95 % CI = 11.05 % - 14.82 % ). The Fu-ao habor in Matsu had the highest seropositive rate ( 22.22 % ). The rodent species which found with the highest seropositive rate was Rattus flavipetcus ( 18.18 % ). The main serogroup discovered was Pomona ( 64.29 %，36/56 ), and the second one was Shermani ( 12.50 %，7/56). The highest geometric mean titres were 1: 229.7 of Autumnalis and 1: 181.6 of Pomona. Besides, to avoid the infectious risks of MAT caused by the operation of live pathogens, and to minimize the operation time, labor and material cost, this study evaluated the recombinant LipL32 protein-based enzyme-linked immunosorbent assay ( rLipL32-ELISA ), and heat stable antigen- sensitized ( from non-pathogenic strain, Leptospira biflexa ) latex agglutination test ( LAT ), for the development of simpler and safer serological screening methods with MAT as the gold standard. The sensitivity, specificity and agreement of rLipL32-ELISA were 95.00 %, 91.34 % and 91.80 %, and 33.33 %, 87.80 % and 82.65 % of LAT, respectively. The kappa value compared with MAT were 0.699 ( 95 % CI = 0.59-0.81 ) of rLip32-ELISA and 0.174 ( 95% CI = -0.27-0.62 ) of LAT. This study revealed a higher seroprevalence of leptospirosis in rodents, especially in habor areas. This should be noticed for the workers in such environments. In the meanwhile, the most prevalent serogroup investigated by this study was Pomona, which is different from the previous surveys during the last decade that mainly serogroup was Shermani. In addition, the rLipL32-ELISA has the potential to be a screening tool for leptospirosis, because of its high sensitivity, specificity, and agreement ( up to 91.80 % ).目 錄 中文摘要………………………………………………………………… II 英文摘要…………………………………………………………………III 目錄……………………………………………………………………… V 圖次…………………………………………………………………… VIII 表次………………………………………………………………………IX 第一章 序言………………………………………………………………1 第二章 文獻回顧…………………………………………………………3 第一節 鉤端螺旋體病與病原的發現……………………………………3 1.1 歷史………………………………………………………………… 3 1.2 鉤端螺旋體的生物特性與分類…………………………………… 5 1.2.1 細菌學特性…………………………………………………………5 1.2.2 分類…………………………………………………………………7 第二節 鉤端螺旋體病的診斷方法………………………………………9 2.1 病原體偵測……………………………………………………………9 2.1.1 培養…………………………………………………………………9 2.1.2 顯微鏡觀察法……………………………………………………10 2.1.3 核酸偵測-聚合酉每鏈反應………………………………………10 2.2 抗體偵測……………………………………………………………11 2.2.1 顯微凝集試驗…………………………………………………… 12 2.2.2 酵素連結免疫吸附法…………………………………………… 13 2.2.3 乳膠凝集試驗…………………………………………………… 13 2.2.4 其他……………………………………………………………… 14 第三節 鉤端螺旋體病的流行病學…………………………………… 16 3.1 人類的鉤端螺旋體病……………………………………………… 16 3.1.1 概述……………………………………………………………… 16 3.1.2 老鼠在人類感染鉤端螺旋體病中扮演的角色…………………. 18 3.2 鉤端螺旋體病在臺灣……………………………………………… 19 3.2.1 人類及其他動物………………………………………………… 19 3.2.2 鼠類……………………………………………………………… 22 第三章 材料與方法…………………………………………………… 24 第一節 鼠類樣本的採集地點與檢體採集方法……………………… 24 第二節 臨床病材病原分離…………………………………………… 24 第三節 顯微凝集試驗法……………………………………………… 25 3.1 所偵測的血清型別………………………………………………… 25 3.2 菌體濃度標準化…………………………………………………… 26 3.3 篩檢………………………………………………………………… 26 3.4 力價判定…………………………………………………………… 26 第四節 以重組LipL32蛋白構成的酵素連結免疫吸附法……………… 27 4.1 重組LipL32蛋白的定量…………………………………………… 27 4.2 rLipL32-ELISA的理想試驗………………………………………… 27 4.3 待測抗體的rLipL32-ELISA檢驗…………………………………… 28 第五節 使用L. biflexa來源之熱穩定抗原致敏化後的乳膠凝集試驗… 29 5.1 熱穩定抗原製備…………………………………………………… 29 5.2 乳膠顆粒的致敏化………………………………………………… 29 5.3 待測抗體的乳膠凝集試驗………………………………………… 29 第六節 統計分析……………………………………………………… 30 第四章 結果…………………………………………………………… 31 第一節 捕獲鼠隻情形………………………………………………… 31 第二節 血清學之檢測結果…………………………………………… 32 2.1 MAT偵測的血清抗體陽性率……………………………………… 32 2.2 rLipL32-ELISA檢測結果………………………………………… 37 2.3 LAT檢測結果……………………………………………………… 39 2.4 臨床病材病原分離結果…………………………………………… 39 第五章 討論…………………………………………………………… 40 第六章 結論……………………………………………………………… 44 參考文獻…………………………………………………………………… 45 附錄………………………………………………………………………… 55 試藥製備方法……………………………………………………………… 55 血清基本資料……………………………………………………………… 57en-US鉤端螺旋體鼠類顯微凝集試驗酵素連結免疫吸附試驗乳膠凝集試驗LeptospirarodentMATELISALatex agglutination testthesis