蔡向榮臺灣大學：獸醫學研究所黃振瑋Huang, Chen-WeiChen-WeiHuang2007-11-282018-07-092007-11-282018-07-092005http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/59906摘要 鳥鼻氣管桿菌 (Ornithobacterium rhinotracheale, ORT) 為一新興之多形性革蘭氏陰性桿菌，主要造成家禽呼吸道疾病，可導致病禽生長遲緩、產蛋率下降，甚至死亡等損失，影響家禽產業甚鉅。ORT在國內之研究甚少，故本研究由雞及鴿氣管中分離病原，並進行生化鑑定、抗菌劑感受性試驗、序列分析及抗體調查。結果顯示，由雞及鴿隻所採集之樣本中，其分離率分別為8.3 % (28/337) 及9 % (12/133)。所有ORT分離株 (40/40) 在API 20NE鑑定系統之生化結果全部一致，生物碼為0-0-2-0-0-0-4。對於alkaline phosphatase、esterase (C4)、esterase lipase (C8)、leucine arylamidase、acid phosphatase、oxidase等酵素反應皆為陽性，而MacConkey、SIM、TSI、catalase、lysine、ornithine、phenylalanine、surcose、sorbitol及dulcitol等生化試驗則全部為陰性反應。各分離株經瓊脂稀釋法進行12種抗菌劑之感受性試驗後，發現大多數分離株(>70%)對於trimethoprim-sulfamethoxazole、erythromycin 及clindamycin有高比例之抵抗性，對ampicillin、amoxicillin、penicillin及ceftiofur則有較佳之感受性 (>85%)。將分離株16S rRNA之PCR產物經定序並與由GenBank所得序列比對後，得知在不同分離株間其核苷酸相似度極高 (98.0~100%) ，但由親緣樹狀圖仍可發現鴿與雞之分離株分屬於不同的群組。在血清學方面，利用市售ELISA 套組檢測白肉雞、有色雞、蛋雞及種雞之ORT抗體，其陽性率分別為29.7% (221/745)、60.7% (403/664)、70.3% (204/290) 及93.9% (341/363)。本論文為台灣雞及鴿隻ORT分離首報，調查結果顯示台灣地區之鳥禽已普遍有ORT感染。Abstract Ornithobacterium rhinotracheale (ORT), a newly recognized pathogen, is associated with respiratory diseases in avian species. To date, little is known about ORT infection in Taiwan. Therefore, tracheal swabs and serum samples were collected from the chickens and pigeons for the isolation, biochemical characteristics, antimicrobial susceptibility, sequence analysis, and antibody survey of ORT. The results showed that the ORT isolation rate of chickens and pigeons were 8.3 % (28/337) and 9 % (12/133), respectively. The identical results of biocode 0-0-2-0-0-0-4 were observed in all the isolates using API 20NE identification system. These isolates showed positive results in alkaline phosphatase (C4), estrase lipase (C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, and oxidase reactions, but negative to MacConkey, SIM, TSI, catalase, lysine, ornithine, phenylalanine, sucrose, sorbitol, and dulcitol reactions. Most isolates (>70%) were resistant to trimethoprim-sulfamethoxazole, erythromycin, and clindamycin, but susceptible to ampicillin, amoxicillin, penicillin, and ceftiofur (>85%) by agar disc diffusion method. As for the analysis of 16S rRNA sequence, high similarities (98–100%) were revealed among the isolates in this study and the previously published sequence data. The chicken and pigeon isolates were divided into different clusters in phylogenetic tree. By using commercial ELISA kits, the antibody positive rates of broilers, hybrid broilers, layers, and breeders were 29.7% (221/745), 60.7% (403/664), 70.3% (204/290), and 93.9% (341/363), respectively. To our knowledge, this is the first report of the isolation of ORT from chickens and pigeons in Taiwan, and the results indicated that ORT infection is common in Taiwan. Abbreviations: SIM, sulfide-indole-motility; TSI, triple sugar iron; ELISA, enzyme-linked immunosorbeat assay.目錄 頁次 誌謝 Ⅰ 中文摘要 Ⅱ 英文摘要 Ⅲ 目錄 Ⅳ 表次 Ⅴ 圖次 Ⅵ 第一章 緒言 1 第二章 文獻探討 2 第一節 歷史回顧 2 第二節 病原分類及特性 2 第三節 感染途徑及潛伏期 3 第四節 臨床症狀 4 第五節 病理學變化 5 5.1 肉眼病變 5 5.2 組織病理學變化 5 第六節 動物接種試驗 6 第七節 診斷 7 7.1 病原分離與鑑定 7 7.2 血清學分型 9 7.3 血清學檢測 10 第八節 流行病學調查 11 第九節 血清學調查 12 第十節 治療與控制 13 第十一節 疫苗接種 14 第三章 材料與方法 16 第一節 細菌分離與鑑定 16 1.1 採樣 16 1.2 分離 16 1.3 PCR鑑定 16 1.3.1 DNA之萃取 16 1.3.2 引子選用 17 1.4 細菌之平板凝集鑑定 18 1.4.1 A血清型ORT高免血清之製作 18 1.4.2 平板凝集試驗 19 1.5 紅血球凝集試驗 19 1.5.1 紅血球懸浮液之製備 19 1.5.2 紅血球凝集試驗 19 1.6 生化鑑定 20 1.6.1 API 20NE快速鑑定 20 1.6.2 API ZYM酵素活性反應套組 21 1.6.3 其它生化試驗 21 1.6.3.1 MacConkey agar 21 1.6.3.2 Triple sugar iron agar 21 1.6.3.3 尿素分解酶試驗 21 1.6.3.4 Indole test 22 1.6.3.5 觸酶試驗 22 1.6.3.6 氧化酶試驗 22 1.6.3.7 糖類利用 22 1.6.3.8 去羧基酶試驗 22 1.7 統計分析 23 第二節 抗菌劑感受性試驗 23 第三節 掃描式電子顯微鏡之觀察 23 第四節 核酸序列分析比較及演化分析 24 第五節 血清學檢測 24 5.1 血清樣本 24 5.2 ELISA試驗 25 5.3 統計分析 25 第四章 結果 26 第一節 細菌分離與鑑定 26 1.1 細菌分離 26 1.1.1 雞分離株 26 1.1.2 鴿分離株 26 1.2 ORT分離株之菌落形態 27 1.3 鑑定 27 1.3.1 PCR檢測結果 27 1.3.2 細菌平板凝集試驗 27 1.3.3 紅血球凝集試驗 28 1.3.4 生化鑑定 28 1.3.4.1 API 20NE快速鑑定結果 28 1.3.4.2 API ZYM酵素活性反應結果28 1.3.4.3 其它生化試驗結果 29 第二節 抗菌劑感受性試驗 29 2.1 雞分離株 29 2.2 鴿分離株 29 第三節 掃描式電子顯微鏡之觀察 30 第四節 核酸序列分析比較及演化分析 30 第五節 血清學檢測 30 第五章 討論 32 參考文獻 65 附錄一 台灣與國外ORT分離株之16S rRNA核酸序列圖 73 附錄二 抗菌劑感受性試驗瓊脂錠擴散法抑制圈直徑參考表 80 附錄三 ORT分離株資料一覽表 81 附錄四 ORT之實驗室診斷方法圖 822083310 bytesapplication/pdfen-US鳥鼻氣管桿菌鼻氣管鳥桿菌Ornithobacterium rhinotrachealeOrnithobacteriosisthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/59906/1/ntu-94-R92629036-1.pdf