許圳塗Shii, Chou-Tou臺灣大學:園藝學研究所陳春賓Chen, Chun-BinChun-BinChen2010-05-052018-06-292010-05-052018-06-292008U0001-2901200817410100http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/180771百合遠緣雜種選用己育成之LA〔L. longiflorum cv.Gelria (LL)× L. ‘Purple Sensation’ Asiatic Lily(AA)〕及LO〔L. longiflorum LD(LL) ×L. ‘Casa blanca’ Oriental Lily(OO)〕選系，花粉母細胞染色體減數分裂檢查，第一次減數分裂前期L和A或L和O基因組間近同源染色體配對頻率低，同時呈鬆弛狀配對，易早熟分離。LA及LO選系在第一次減數分裂中期出現16-24個單價體(univalents)為主其12對近同源染色體配對頻率分別為4.18± 2.69 (Ⅱ)與1.04 ± 1.25 (Ⅱ)。顯示L與O兩基因組間遺傳親緣性為較低，第一次減數分裂後期，因近同源單價染色體無法完全配對及無法對稱分離，致使雙隅子(dyad)遺傳不平衡。接續第二分裂異常，減數分裂產物大小不一，同時數目會超過四分子，小孢子呈不整數染色體組無法形成有機能花粉，經由化學染色、螢光檢查及發芽測試皆顯示沒有活力。參試LA及 LO選系微體繁殖，為利用試管內保存小植株之小鱗片為培殖體，接種於1/2 MS培養基，分別添加2,4-D 0.1及0.5 mg / L，可誘導多數不定芽再生。兩選系小鱗片縱切體外誘變預處理，為接種於修正1/2 MS配方，添加不同濃度Oryzalin 7~28 μΜ培養液，30~90分鐘，爾後移至再生培養基，誘導不定芽，長成小植株並經氣孔形態調查及流式細胞儀細胞核DNA含量分析。初代誘變系第一輪篩檢LA及LO百合氣孔保衛細胞形態，結果顯示，氣孔形態平均分別為長 × 寬為101.4 ± 6.68 μm × 21.2 ± 1.9 μm及長 × 寬為105.06 ± 5.21μm × 21.05 ± 3.37 μm；分別為兩倍種1.65 × 1.45倍及1.4 × 1.29倍，取得四倍體細胞鑲嵌株誘變系頻率分別為46.9 ％ 和 57.9 ％，總鑲嵌頻度變化11.1~71.9 ％，LA及LO誘變系DNA含量篩檢分別為4C=170.82及4C=167.07，均為2C之2倍。選取篩檢值為4C單peak DNA含量四倍體LA及LO百合誘變系為5株誘變系及16株誘變系。第二輪檢定第一輪篩選出21株具單peak 4C DNA檢測值之四倍體LA及LO百合誘變系，篩檢其新生長且成熟葉片交互檢測形態誌、核DNA含量及根尖細胞學檢查(4X=48)，確認取得實質四倍體誘變株分別為1株及4株，誘變率分別為1.23 %及 2.37 %，由第二輪篩檢結果顯示，以浸漬90分鐘、Oryzalin濃度為28 μΜ之試驗處理組合為佳。誘變系再生二代第一輪及第二輪篩檢，分別取得不同培殖體鑲嵌誘變系，並分別自15株及82株鑲嵌誘變系純化篩檢獲得1株及7株再生二代四倍體誘變系，鑲嵌誘變系分離純化效率分別為6.67 %及8.54 %。植株氣孔密度分別為417.5 ± 65.0 / cm2(個) 及401.7 ± 52.1 / cm2(個)，分別約為兩倍體種的0.56倍及0.53倍，且根尖細胞學檢查均為4X等於48條染色體。誘變株LA及LO核DNA質量比對百合L. davidii細胞，分別估算為4C=159.57 ± 9.14 pg及4C=141.04 ± 4.67 pg亦接近為原雜種兩倍。檢定為實質四倍體各誘變系已微體繁殖中，供瓶外栽培及生長勢評估。國立臺灣大學(碩)博士學位論文口試委員會審定書…………….…...….i文摘要………………………………………………………….....…….iiibstract………………………………………………………………….....v錄………………………………………………………………………...1、 前言...............................................................................................11、 前人研究.......................................................................................13一）、多倍體化的重要性.........................................................................13二）、有性多倍體之未減數配子形成(sexual, meiotic polyploidization)及其遺傳特性.....................................................................................14.減數分裂復合...................................................................................15.巨型孢子(Jumbo pollen)之形成.......................................................15.減數分裂後複合(Post meiotic restitution)………………...………15三）、無性多倍體途徑(asexual, mitotic polyploidization)……...……..16.自然生成……………………………………………………...........16.人為操作…………………………………………….…..….……...161.）Oryzalin誘變之調控機制………………………….….…….172.）誘變劑對kinetochore於細胞分裂時之作用機制與倍數體化之關係………………………..……………………………..19. Kinetochore之組成………………………………..……….19i. Chenkpoint Mad2…………………………………..….......20ii. Mad2之兩種機能模式………………………….………..21四）、百合遠緣雜種體外多倍體誘導…………………………..…….21、 材料與方法……………………………………………….……..24一) 遠緣雜種LA及LO百合花粉活力分析………….….……………24二) 遠緣雜種LA及LO百合微體繁殖……………………..…………25三) 遠緣雜種LA及LO百合體外多倍體誘導試驗…………………..25四) 遠緣雜種LA及LO百合多倍體檢定及相關植株性狀調查……26.多倍體植株檢定…………………………………………….……261.) 初代擬純質多倍體第一輪篩檢循環…………….....…….26. 細胞形態檢定…………………………………….…….26i. DNA相對含量檢定……………………………..……..272.) 初代實質多倍體第二輪篩檢循環………………………28. 細胞學根尖染色體數檢查……………………..………283.) 鑲嵌誘變系分離純化再生二代擬純質多倍體第一輪篩檢循環………………………………………………………..294.) 鑲嵌誘變系分離純化再生二代實質多倍體第二輪篩檢循環…………………………………………………………..29.植株性狀調查……………………………………………….……301.)葉片壽命……………………………………………..……..302.)葉片之厚度測定…………………………………......……..303.)氣孔之密度測定…………………………………...….........30、 結果………………………………………………………...……31一)遠緣雜種LA及LO二倍體百合花粉稔實率分析………………..31二)遠緣雜種LA及LO百合微體繁殖……………………..................32三) LA及LO遠緣雜種百合多倍體篩檢及相關植株性狀調查……..33. 多倍體誘變系篩檢…………………………………….………331.) 初代擬純質多倍體第一輪篩檢循環……………………34.多倍體百合誘變系氣孔保衛細胞形態篩檢……........34i.百合誘變多倍體DNA含量篩檢…………………….352.) 初代擬純質多倍體第二輪篩檢循環……………………35. 細胞學根尖染色體數篩檢…………………………..353.) 鑲嵌誘變系分離純化再生二代擬純質多倍體第一輪篩檢循環………………………………………………………364.) 鑲嵌誘變系分離純化再生二代實質多倍體第二輪篩檢循環…………………………………………………………36.植株性狀調查…………………………………………...………381.) 葉片厚度測定分析……………………………......……..382.) 氣孔密度測定分析……………………………….....…...383.) 葉片壽命記錄分析……………………………......……..38、 討論……………………………………………………...………40一) 二倍體遠緣雜種百合花粉近同源配對特性及花粉稔實率分析………………………………………………………………...40二) 強效生長調節劑對遠緣雜種百合微體繁殖增殖特性………………………………………………………………...41三) 遠緣雜種LA及LO百合多倍體誘變系篩檢及植株特性………………………………………………………………...42百合多倍體誘變系細胞形態氣孔保衛細胞篩檢……...……...42.百合多倍體誘變系DNA含量篩檢……..…………………….43 (1.) 非包覆型鑲嵌誘變系植株………………………………44 (2.) 包覆型鑲嵌誘變系植株…………………………………44.百合多倍體誘變系細胞學根尖染色體數篩檢……………….45.二倍體及四倍體百合植秼性狀….……………………………47、 參考文獻…………………………..…………………………….98表………………………………………………………………...107 附圖………………………………………………………………...109application/pdf3935488 bytesapplication/pdfen-US離體多倍體誘變2n未減數配子遠緣雜種百合Oryzalin流式細胞儀in vitro polyploidization2n gametehybrid liliumFlowcytometrythesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/180771/1/ntu-97-R94628144-1.pdf