費昌勇臺灣大學：獸醫學研究所張祖駿Chang, Tzu-ChungTzu-ChungChang2007-11-282018-07-092007-11-282018-07-092004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/59904犬艾利希氏體病，是一種由立克次體所引起的疾病。由於感染時的臨床症狀不具特異性，往往不易診斷。臨床上，目前對於診斷犬艾利希氏體病主要仍然依靠光學顯微鏡鏡檢及商品化kit為主，但是都有其缺點。本研究選擇以巢式聚合酶連鎖反應(nested-PCR)的方式，針對不同種類犬艾利希氏體之16S rRNA基因序列作引子設計，以調查台北市各動物醫院所送檢之疑似病例感染情況，並對臨床上造成的病害及和焦蟲混合感染的情況作了解。目前已由所收集的174個疑似病例中檢驗出29個E. canis及2個E. platys之陽性病例，並定序確認。此外亦收集了台北市動物之家所提供的流浪犬隻血液作檢驗，初步於31個血液樣本中，分別檢測出4，11及2例E. canis，E. platys及E. equi陽性病例。在16S rRNA基因序列分析上，也已定序出台北地區E. canis及E. platys之全長約1400bp的16S rRNA基因序列，並以DNASTAR 程式(DNASTAR Inc., Madison, WI)和國外已發表之序列作親緣性分析。Canine ehrlichiosis is a tick-borne disease caused by obligate intracellular parasites of the genus Ehrlichia. The diagnosis is difficult, because the clinical signs of canine ehrlichiosis are always not specific. Microscope and commercial kit are usually used for clinical diagnosis. However, some disadvantages exist in these diagnostic methods. We established nested-PCR with primers derived from the 16S rRNA gene sequence to study the infection rate, pathology, and coinfection with Babesia spp. of suspicious sample from animal hospitals in Taipei and Taipei Municipal Animal Shelter. We had designed five Ehrlichia-species-specific primers, and were able to amplify E. canis (29/174)and E. platys(2/174) of owned dogs as well as E. canis (4/31), E. platys(11/31)and E. equi (2/31) of stray dogs sampled from Taipei Municipal Animal Shelter. At the same time, we have sequenced the full 16S rRNA gene sequences of E. canis and E. platys, and compared with the other strains in gene bank by DNASTAR.目錄------------------------------------------------------I 表次---------------------------------------------------IV 圖次----------------------------------------------------VI 中文摘要-----------------------------------------------VIII 英文摘要------------------------------------------------ IX 第一章 緒言-------------------------------------------1 第二章　文獻探討----------------------------------------3 第一節 犬艾利希氏體的分類地位與外觀型態----------3 1.1 分類地位----------------------------------3 1.2 外觀型態----------------------------------5 第二節 分佈及感染狀況---------------------------7 第三節 感染方式--------------------------------10 第四節 免疫反應及致病機制------------------------11 第五節 致害性------------------------------------15 5.1 臨床上的分期-----------------------------15 5.2 在犬造成的臨床症狀-----------------------17 5.3 在人造成的病害--------------------------21 第六節 血液相的變化----------------------------22 6.1 血球相的變化--------------------------22 6.2 血清生化學的變化--------------------------26 第七節　病理變化--------------------------------27 7.1 肉眼病變------------------------------27 7.2 組織病變------------------------------28 第八節　診斷方法---------------------------------31 第三章　材料與方法---------------------------------------39 第一節　試驗設計----------------------------------39 第二節　臨床上檢體收集----------------------------40 第三節 萃取DNA-----------------------------------40 第四節　建立PCR偵測技術--------------------------42 第五節　PCR特異性(specificity)試驗------------------46 第六節　瓊脂電泳分析-----------------------------47 第七節　自電泳膠體回收純化DNA片段---------------49 第八節　核酸定序-------------------------------50 第九節　E. canis及E. platys的整段16S rRNA基因序列的定 序及比對----------------------------------51 第十節　針對艾利希氏體陽性檢體偵測是否有焦蟲感---53 第四章　結果---------------------------------------------55 第一節　艾利希氏體蟲體的血液抹片觀察--------------55 第二節　PCR反應條件的測定------------------------55 第三節　PCR特異性(specificity)試驗結果--------------56 第四節　以特異性引子針對臨床檢體進行PCR反應及定序結 果----------------------------------------58 第五節 以特異性引子針對臨床檢體進行檢測確認的台北市 犬艾利希氏體病例--------------------------58 第六節　台北市地區所發現之E. canis及E. platys的整段16S rRNA基因序列的核酸定序及比對分析---------61 第五章 討論---------------------------------------------65 結論與未來展望-------------------------------------------74 參考文獻------------------------------------------------108 表次 表一、以16S rRNA基因序列的分析，艾利希屬可分為3種基因型 (genogroup)------- ---------------------------------75 表二、犬艾利希體症核酸檢驗申請書--------------------------76 表三、犬艾利希體症核酸檢驗申請書送檢說明------------------77 表四、以引子E1、E2針對Ehrlichia genus作第一次PCR反應之試 劑參考配方-----------------------------------------78 表五、以引子ECf、E4針對E.canis作巢氏PCR反應之試劑參考配方 ---------------------------------------------------79 表六、以引子EPf、E5及EEQ、E5針對E. platys及E. equi作巢氏 PCR反應之試劑參考配方------------------------------80 表七、以引子EPf、E5及EEQ、E5針對E. platys及E. equi作巢氏 PCR反應之試劑參考配方------------------------------81 表八、以引子作PCR反應檢測送檢病例及流浪犬隻病例結果 -----------------------------------------------82 表九、比對台北市所發現之E. canis整段16S rRNA基因序列和國外 所發表的不同---------------------------------------83 表十、比對台北市所發現之E. platys整段16S rRNA基因序列和國外 所發表的不同---------------------------------------84 表十一、以PCR反應針對臨床上病例所檢驗出的E. canis及E. platys 陽性病例-------------------------------------------85 圖次 圖一、2001年Dumler等人以16S rRNA基因作艾利希氏體各種類的 親緣樹狀圖分類-------------------------------------88 圖二、艾利希氏體的傳播及致病機轉-----------------------89 圖三、以Liu’s stain染色法於臨床上所觀察到的E. canis陽性病例--90 圖四、以Liu’s stain染色法於臨床上所觀察到的E. platys陽性病例-91 圖五、E. canis之16S rRNA部分序列定序結果------------------92 圖六、E. platys之16S rRNA部分序列定序結果------------------93 圖七、E. equi之16S rRNA部分序列定序結果-------------------94 圖八、引子E1-E2特異性實驗--------------------------------95 圖九、引子ECf-E4特異性實驗-------------------------------96 圖十、引子EPf-E5特異性實驗-------------------------------97 圖十一、引子EEQf-E5特異性實驗--------------------------98 圖十二、E. canis的整段16S rRNA基因核酸序列的定序結果------99 圖十三、E. platys的整段16S rRNA基因核酸序列的定序結果-----101 圖十四、以DNASTAR軟體分析台北市所發現之E. canis整段16S rRNA基因序列和國外所發表的相似度---------------103 圖十五、以DNASTAR軟體分析台北市所發現之E. platys整段16S rRNA基因序列和國外所發表的相似度---------------104 圖十六、將實驗定序出的整段E. canis 16S rRNA基因序列以 DNASTAR軟體和國外發表的strains比較所繪製之親緣樹 狀圖-------------------------------------------105 圖十七、將實驗定序出的整段E. platys 16S rRNA基因序列以 DNASTAR軟體和國外發表的strains比較所繪製之親緣樹 狀圖--------------------------------------------106 圖十八、所檢出的犬艾利希氏體家犬陽性病例中，常見之血液相變化 --------------------------------------------1071034833 bytesapplication/pdfen-US艾利希氏體EhrlichiosisEhrlichiathesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/59904/1/ntu-93-R91629017-1.pdf