林淑華2006-07-262018-07-062006-07-262018-07-062004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/27784A 型血友病是由於病人血液中缺乏第八因子活性所造成，此疾病為性聯 遺傳，在男性發生率約五千到一萬分之一。第八因子由肝臟合成分泌，在血 漿中第八因子濃度非常低（約為100ng/ml），與構造相似的蛋白－第五因子相 比低了100 倍。已知無任何細胞株可自然表現此蛋白，而體外細胞培養系統 也無法大量合成第八因子（表現量比其它重組凝血因子蛋白低一百到一千 倍），使得第八因子在生合成及結構功能的相關研究、治療用蛋白的開發，以 及基因治療上都受到限制。為了建立高產量的重組第八因子表達系統及適合 活體細胞內觀察方法，以研究第八因子蛋白在細胞的生合成及運轉過程，故 進行下列實驗：一、利用肝細胞專一載體pBS-HCRHPI-A 於肝癌細胞株中表 達全長之重組第八因子蛋白。二、參照hydrodynamics- based transfection 建立 小鼠活體內重組第八因子蛋白表達系統。三、以FlAsH- EDT2 染劑進行第八 因子蛋白在肝細胞內之活體標定。四、利用高純度的重組第八因子蛋白進行 抗第八因子單株抗體之製備。五、參照血友病人的基因突變，建構六個點突 變第八因子表達質體（突變146、386、1689、1789、1823 及1942），並合成 其重組蛋白，來進行相關研究。本研究目前已完成所有質體之建構，並以DNA 定序確認；在活體外培養哺乳動物細胞株表達系統中，進行穩定表達重組第 八因子蛋白細胞株之選殖；在小鼠活體表達系統中，除已建立相關條件和分 析方式外，分析更偵測到蛋白表達量較以往表達系統高出500 倍之多。另外 於活體標記系統上，已完成活體標定染劑FlAsH- EDT2 最適宜濃度及相關染 色步驟的測試；在抗第八因子單株抗體之製備上，也挑選出八個細胞聚落進 行第二次限數稀釋，以得單株化細胞株。未來可利用活體標記技術，在活體 外及表現量超高的活體小鼠表達系統，分析正常第八因子在肝細胞內生合成 2 及運轉過程，以探討第八因子低表現量的原因外；更可比較該過程於正常第 八因子及病人的突變蛋白之異同，以了解第八因子各結構功能區之可能功 能，以期將來可應用於更高效能、更具經濟價值之治療用重組第八因子蛋白 之開發。application/pdf292306 bytesapplication/pdfzh-TW國立臺灣大學醫學院醫學檢驗暨生物技術學系凝血第八因子哺乳細胞表達系統A 型血友病的致病的分子機制journal articlehttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/27784/1/922314B002264.pdf