2012-08-012024-05-13https://scholars.lib.ntu.edu.tw/handle/123456789/649950流行病學研究指出，臺灣地區口腔黏膜下纖維化症(OSF) 及口腔癌的發生與嚼檳榔有密切關係。OSF亦被視為口腔癌前期狀態，惡性轉變率可達7.6%。 目前，口腔癌在臺灣男性十大癌症中死亡率與發生率皆居第五位，是臺灣地區年增率最高之癌症。雖然檳榔致癌的證據日漸充足，但檳榔致癌及OSF機制仍未詳細闡明。一般認為OSF是檳榔嚼塊內粗糙纖維長期摩擦黏膜產生微創傷(microtrauma) 及檳榔萃取物的細胞毒性，使檳榔內成份滲入表皮以及結締組織，經由檳榔內成份合併微創傷產生的直接作用及引起的發炎反應所致。在各種促進纖維化因子中，以TGF-β被認為扮演最關鍵的角色，但因其生理功能很多而不適宜做治療標靶。結締組織生長因子(CTGF)是TGF-β促纖維化作用中的一個重要分子，幾乎所有TGF-β參與細胞外間質合成的功能，都需要CTGF的參與。CTGF的過度表現曾被報告和許多器官纖維化有密切關係。動物實驗發現，CTGF中和抗體、siRNA可減緩TGF-β誘發的纖維化。我們最近發現CTGF在OSF的病變過程中扮演一個很重要的角色，也是治療OSF的一個新的標靶。雖然過去研究發現22% OSF患者黏膜有小出血點，病患的唾液中也發現類凝血酶，但近20年來的研究幾乎都致力於探討檳榔成份引發OSF及口腔癌的機轉。微創傷引發凝血酶(thrombin)釋出扮演的角色未有研究。因此我們於一年前開始凝血酶及其受體(PAR-1) 在OSF及口腔癌致病機轉中扮演角色之研究。 我們初步研究正常口腔頰黏膜纖維母細胞(BMF)中凝血酶誘導CTGF表現的訊息傳遞路徑，希望可以更深入瞭解OSF的病變過程，未來或許可以預防或治療OSF。結果發現凝血酶透過 PAR-1/ROS/ASK/JNK 路徑誘導BMF中CTGF表現。由於在多種組織纖維化疾病中，組織基質細胞活化成為肌纖維母細胞（myofibroblast; MFB）被認為是造成纖維化的關鍵因素，阻止MFB的產生被認為有助於纖維化疾病的預防和治療。最近，Angadi 等人 (2011)利用α- SMA 做標記，發現OSF 中有較多的MFB，且其數目與疾病的嚴重度呈正相關。我們以凝血酶處理 BMF， 結果發現凝血酶能刺激BMFs 的α-SMA表現。但現今的文獻並沒有報導有關BMF中凝血酶誘導MFB產生的訊息傳遞路徑。腫瘤是個有許多不同細胞的複合結構。過去大多數的研究專注在了解正常細胞轉變成癌細胞的過程，研究腫瘤基質細胞的則著墨較少。但最近幾年，越來越多研究顯示腫瘤微環境中，腫瘤基質細胞(大多數為 α-SMA陽性的MFB)對於腫瘤的發生和後續發展與轉移和腫瘤細胞是一樣重要的。許多 in vivo及in vitro研究中都看到 MFB 可以促使腫瘤形成，增進生長及侵襲。Marsh 等人 (2011) 分析282 例口腔癌檢體發現，腫瘤基質α-SMA細胞數目為影響存活時間的獨立因子。口腔癌腫瘤基質MFB對於腫瘤的發展與轉移非常重要。測量口腔癌MFB有助於腫瘤的預後判斷。 由於腫瘤基因不穩定，瞄準癌症周圍環境的新藥或許會比那些直接專一對抗癌細胞的藥更為有效果。 阻斷纖維母細胞轉化為MFB的作用，或許有助於抑制腫瘤的生長和轉移。50-90%癌症病人可在常規實驗室檢查中發現高凝血性狀態。頭頸部癌症亦不例外。近年來研究發現癌症病人伴隨血栓疾病者有較多腫瘤轉移與較短的生存期間。研究指出，凝血酶可促進腫瘤的增殖、轉移及血管新生。但是其詳細機制並不十分清楚。研究指出，凝血酶第一型蛋白酶活化受體 (PAR-1)基因可轉形 NIH3T3， 被認為是癌基因。 Bar-Eli 團隊(2011)對黑色素癌的研究中發現，具有較高PAR-1表現的細胞株在動物實驗中具有較高的血管新生，侵襲與轉移能力， 給予PAR-1 siRNA， 可以抑制其血管新生，侵襲與轉移能力。 但是PAR-1在口腔癌扮演的角色，及其致癌機轉並不清楚。我們初步研究發現凝血酶和 PAR1 agonist可以增加口腔癌細胞的migration 及 invasion。因此我們擬進一步瞭解凝血酶及PAR1對口腔癌細胞的影響。並進一步瞭解PAR1在口腔癌扮演的角色，及其致癌機轉。 我們初步應用免疫組織化學染色技術研究凝血酶受體PAR-1在口腔癌中的表現情況，結果發現25/28 (90%)口腔癌檢體有PAR-1過度表現。且其表現和腫瘤大小、淋巴結轉移與否、癌症臨床分期有關。已知嚼檳榔與OSF和口腔癌發生有密切關係， 但其致病機轉並未完全明暸。我們初步研究成果發現凝血酶透過 PAR-1/ROS/ASK/JNK 路徑誘導BMF中CTGF表現。凝血酶 能刺激BMFs 的α-SMA表現。凝血酶和 PAR1 agonist可以增加口腔癌細胞的migration 及 invasion。PAR-1過度表現亦與臺灣口腔癌有密切關係。但是凝血酶和PAR-1在OSF與口腔癌致病機轉中扮演的角色，還有其致癌機轉，至今仍不清楚。所以，我們提出本三年計劃擬於三年內逐步探討凝血酶和PAR-1在OSF與口腔癌致病機轉中扮演的角色，預後價值，致癌機轉，及其防治策略。 為達到此目標，本計劃包含以下數個研究主題：我們第一年擬 1. 以α-SMA抗體對150位罹患口腔癌病患之組織病理切片進行染色，並將其結果與STNM status、癌症轉移、預後及嚼食檳榔、抽煙和飲酒習慣等參數，進行統計分析。了解α-SMA的表現於臺灣的口腔癌是否有預後價值? 提供將來治療的參考。 2. 探討BMF中thrombin 誘導MFB (α-SMA表現, 膠原蛋白膠收縮)產生的訊息傳遞路徑及機制。擬加入BMF鈣離子通道阻斷劑，calcium/calmodulin抑制劑，myosin light chain kinase抑制劑，Rho kinase抑制劑， phospholipase C抑制劑，IP3 受體拮抗劑，p38 MAP kinase, JNK, ERK, NF-κB，PI3K等等的抑制劑，探討thrombin是否經由上述路徑誘導細胞成為MFB。3. 擬加入細胞內Rac1，Rho-associated protein kinases，geranylgeranyltransferase，farnesyl transferase 抑制劑，thrombin是否經由Rho GTPase路徑誘導細胞成為MFB。4. 以得知的誘導路徑尋找可抑制thrombin誘導細胞產生MFB的化學預防藥物。5. 觀察thrombin 處理之口腔纖維母細胞與口腔癌細胞株合併是否會促進口腔癌細胞株在裸鼠體內形成腫瘤之能力?我們第二年擬 1. 探討thrombin和 PAR1 agonist促進口腔癌細胞migration 及 invasion的訊息傳遞路徑。擬加入BMF鈣離子通道阻斷劑，calcium/calmodulin抑制劑，myosin light chain kinase抑制劑，Rho kinase抑制劑， phospholipase C抑制劑，IP3 受體拮抗劑，p38 MAP kinase, JNK, ERK, NF-κB，PI3K等等的抑制劑，探討thrombin是否經由上述路徑誘導增加口腔癌細胞的migration 及 invasion。2. 擬加入細胞內Rac1，Rho-associated protein kinases，geranylgeranyltransferase，farnesyl transferase 抑制劑，thrombin是否經由Rho GTPase路徑誘導增加口腔癌細胞的migration 及 invasion。3. 以得知的誘導路徑尋找可抑制thrombin誘導增加口腔癌細胞的migration 及 invasion的化學預防藥物。4. thrombin誘導增加口腔癌細胞的migration 及 invasion 是否與matrix metalloproteinase (MMP)-1, MMP-2, MMP-8, MMP-9, tissue inhibitor of MMP (TIMP)-1, TIMP-2, urokinase-type plasminogen activator (uPA), the uPA receptor (uPAR) 相關 ? 5. 以PAR-1抗體對150位罹患口腔癌病患之組織病理切片進行染色，並將其結果與STNM status、癌症轉移、預後及嚼食檳榔、抽煙和飲酒習慣等參數，進行統計分析。了解PAR-1的表現於臺灣的口腔癌是否有預後價值? 提供將來治療的參考。6. 選殖人類PAR-1基因 7. 將 PAR-1 轉殖到 PAR-1 表現量較低的口腔癌細胞株Ca9-22中，選取兩株 PAR-1 蛋白表現量高於控制組的細胞株將其命名 Ca9-22/PAR1#1，Ca9-22/PAR1#2。8.以動物實驗觀察比較Ca9-22/PAR1#1，Ca9-22/PAR1#2生長速率、促血管新生能力及存活時間的改變。我們第三年擬繼續研究PAR-1在口腔癌致病機轉中扮演的角色。1. 由於先導實驗發現PAR1的表現和腫瘤大小、淋巴結轉移與否、癌症臨床分期有關。 因此我們擬於 In Vitro 比較Ca9-22/PAR1#1，Ca9-22/PAR1#1 和控制組細胞株其移動能力、侵襲能力的改變。 2.先前研究發現thrombin 可以增加細胞生長， PAR-1表現細胞株的生長速率比對照組快，但其作用機轉僅知經由c-fos及cyclin D。 我們擬進一步比較觀察Ca9-22/PAR1#1 ，Ca9-22/PAR1#2 和控制組細胞株細胞形態, 細胞週期, 細胞週期蛋白, 細胞週期相關蛋白(Aurora-B, INCENP, DNA-PK, pericentrin, Eg5, NuPARP) 的不同。 5. 測試PAR-1的大量表現是否可減輕藥物(如cisplatin, 5-FU, taxol)所引起的細胞凋亡。以確定PAR-1的表現是否會改變口腔癌細胞抗細胞凋亡的能力，而與其致癌力，抗藥性的獲得及惡性度的改變有關??。6. 前述我們實驗室中所擁有的多株口腔癌細胞株中，以 SAS的PAR-1表現量較高。本計劃擬以 shRNA 技術刪除口腔癌細胞株 SAS 的PAR-1表現，先於 In Vitro 比較SAS-AS- PAR1#1， SAS-AS- PAR1#2和控制組SAS/Puro 之間生長速率、移動能力、侵襲能力的改變， 然後以動物實驗觀察比較接種刪除PAR-1的SAS-AS- PAR1#1， SAS-AS- PAR1#2和控制組SAS/Puro在SCID 小鼠體內腫瘤的體積大小、促血管新生能力及存活時間的改變。2. 擬比較觀察SAS-AS- PAR1#1， SAS-AS- PAR1#2和控制組SAS/Puro細胞株細胞形態, 細胞週期, 細胞週期蛋白, 細胞週期相關蛋白的不同。本計劃結束後，未來可用Microarray的方法，比較Ca9-22/Neo和Ca9-22/ PAR1#1 、Ca9-22/PAR1#2基因表現差異。比較SAS/Puro和刪除SAS-AS- PAR1#1， SAS-AS- PAR1#2 細胞株基因表現的差異。比較thrombin 處理與未處理細胞株，將這個結果互相比較。挑選具有相同差異未被報告的基因五個，進一步測試。檳榔口腔癌凝血酶第一型蛋白酶活化受體訊息傳導預後