張震東Chang, Geen-Dong臺灣大學:生化科學研究所翁于婷Weng, Yu-TingYu-TingWeng2010-05-042018-07-062010-05-042018-07-062009U0001-2807200917060700http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/178900細胞因為機械壓力或外力所造成短細胞膜傷害，在細胞膜受傷後，細胞內會接觸到細胞外相對氧化的環境，造成胞內蛋白質被氧化形成蛋白質聚集(protein aggregates)。此外，細胞外Ca2+大量進入細胞內，促進液泡融合(vesicles fusion)或胞吐作用(exocytosis)於損傷處形成膜狀區塊，防止細胞內物質持續溢出細胞。之後細胞會進行胞吞作用(endocytosis)產生內吞體(endosome)移除細胞膜上的修補區域，而促進細胞膜的組成復原。目前還沒有人提出細胞膜傷害後，蛋白質聚集、膜狀區塊以及內吞體是如何被清除。篇論文中，利用磁珠滾動的方式大規模傷害細胞的細胞膜後，發現在滾珠後四小時會誘發自噬作用。若3-methyladenine (3-MA)抑制自噬作用則會使滾珠後細胞的存活率下降，顯示自噬作用可輔助細胞膜修補來增加細胞的存活率。此外，我們發現HDAC6不參與此類的自噬作用，而且此類的自噬作用並不幫助清除polyubiquitined proteins。由於蛋白質聚集、膜狀區塊以及內吞體沒有polyubiquitination，應該不是透過ubiquitin的途徑來降解，而且它們的分子量都很大，因此細胞滾珠後誘發的自噬作用可能可以幫助清除蛋白質聚集、膜狀區塊以及內吞體的機制。Transient plasma membrane disruptions commonly occur in cells that experience mechanical stress or external force. From what we have known, disruption of the plasma membrane would lead to the exposure of the cell interior to the external oxidizing environment and change the oxidation state of proteins in cells. These oxidized proteins would become extensively aggregated or cross-linked and attach to the disrupted plasma membrane. Furthermore, extracellular Ca2+ would enter cells, promoting vesicle fusion and exocytosis to form membrane patches that prevent cell contents from spilling out of cells. Afterward, damaged cells proceed to endocytosis and the formation of endosomes that promote the replacement of wound areas in plasma membrane. Protein aggregates, membrane patches, and endosomes that occur during plasma membrane disruption might cause cell stress. At present, it remains unclear how protein aggregates, membrane patches, and endosomes are eliminated in cells after membrane damage.ere, the results suggest that membrane damage at 4 hour after magnetic beads rolling is able to induce autophagy. By blocking autophagy with 3-methyladenine (3-MA), cell viability decreased after beads rolling. These results imply that autophagy participates in membrane repair. Moreover, we found that polyubiquitination and HDAC6 were not involved in the autophagic process following membrane damage and repair. Since ubiquitination plays a minimal role, autophagy, an alternative pathway caused by beads rolling, might help to eliminate protein aggregates, membrane patches and endosomes.目錄試委員會審定書謝 Ⅰ文摘要 Ⅱ文摘要 Ⅲ寫表 Ⅷ一章 前言一節 細胞膜修補(membrane repair) -1 細胞膜修補步驟 1-2 感應細胞膜受傷及液泡聚集 1-3 液泡融合和胞吐作用形成膜狀區塊 2-4 胞吞作用移除細胞膜上傷口 3-5 Tissue transglutaminase(TG)與細胞膜修補 3-6 Calcium phosphate binding protein-胎兒蛋白(Fetuin A) 4細胞膜修補二節 自噬作用(Autophagy)和自噬體(Autophagosome)-1 自噬作用的定義與形式 5-2 參與自噬體的蛋白質及marker 5-3 自噬作用藉由HDAC6抑制神經退化疾病 6三節 研究動機與目的　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　8 二章 材料與方法一節 細胞培養 9二節 細胞滾珠 9三節 cell lysate的萃取 9四節 SDS聚丙烯胺凝膠電泳[Sodium Dodecyl Sulfate－ 9olyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)] 五節 西方點墨法 (Western Blotting) 10六節 免疫螢光染色 (Immunofluorescence Staining) 11七節 建構EGFP-LC3 plasmid-1 引子(Primer)的設計 12-2 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 12-3 洋菜膠電泳分析 (Agarose Gel Electrophoresis) 12-4 DNA去鹽 (Desalt) 13-5 DNA片段磷酸化 13-6 洋菜膠回收 13-7 PGEMT vector與DNA的接合反應(Ligation)和E. Coli細胞轉型 14 (Transformation) -8 菌落聚合酶連鎖反應 (Colony-PCR) 14-9 E. Coli液態培養 15-10 質體DNA(Plasmid)的抽取 15-11 核酸限制酶切割 (Digestion of Restriction Enzyme) 15-12 EGFP-C1 vector與DNA的接合反應 (Ligation) 15八節 細胞轉染 (Transfection) 16九節 MTT assay 16十節 藥物處理 17三章 實驗結果一節 細胞膜傷害後引起自噬反應 18二節 細胞膜傷害後引起適量的自噬作用可增加細胞存活率 19三節 HDAC6不參與細胞膜傷害後引起的自噬作用 20四節 細胞膜傷害後引起自噬作用不幫助清除polyubiquitined 21roteins 五節 細胞膜傷害後HDAC6立即減少並非進入細胞核內 22四章 討論一節 自噬作用與膜狀區塊和內吞體 23二節 自噬作用與氧化壓力 23三節 自噬作用與HDAC6 24四節 自噬作用與p38MAPK 24五節 HDAC6大量溢出細胞 25五章 圖表 1 細胞膜受傷後Fetuin A聚集在細胞膜表面隨後被清除 262 磁珠滾動傷害細胞的細胞膜後四小時誘發自噬作用 273 磁珠滾動傷害細胞的細胞膜後四小時利用免疫螢光染色觀察 28utophagosome 4 磁珠滾動傷害細胞的細胞膜後四小時利用細胞轉染EGFP-LC3B 29lasmid觀察autophagosome 5 磁珠滾動傷害細胞的細胞膜後四小時利用細胞轉染EGFP-LC3B plasmid及 30C3B免疫螢光染色觀察自噬體6 3-methyladenine(3-MA)抑制自噬作用與Rapamycin促進自噬作用對 31胞膜傷害後A431-Ⅲ細胞存活的影響 7 HDAC6對細胞膜傷害後引起自噬作用的影響 338 HDAC6不參與細胞膜傷害後引起的自噬作用 359 細胞膜傷害後引起自噬作用不幫助清除polyubiquitined proteins 3710 細胞膜傷害後HDAC6立即減少並非進入細胞核內 39六章 參考文獻 40七章 附錄錄1 Mitsugumin53 (MG53)可感應細胞膜受傷並促進細胞內液泡聚集 46錄2 Dysferlin可幫助液泡移動到細胞膜受傷的地方並促進液泡融合 47錄3 溶酶體(lysosome)是主要參與膜狀區塊形成的液泡 48錄4 液泡在細胞膜受傷的位置進行融合和胞吐作用，形成膜狀區塊 49錄5 Macroautophagy的形成 50錄6 mTOR pathway 51錄7 3-methyladenine (3-MA)抑制自噬作用 52application/pdf5657416 bytesapplication/pdfen-US自噬作用細胞膜修補HDAC6ubiquitinautophagymembrane repairhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/178900/1/ntu-98-R96b46010-1.pdf