謝旭亮臺灣大學：植物科學研究所杜信杰Du, Xin-JieXin-JieDu2007-11-272018-07-062007-11-272018-07-062005http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/57989FIN219位於phyA下游，為遠紅光訊息傳遞因子，在遠紅光下能抑制阿拉伯芥下胚軸之延長。由先前的實驗得知，大量表現FIN219，造成轉殖株對遠紅光、藍光及白光過度敏感，因此推測FIN219可能參與了藍光的訊息傳訊。以酵母菌雙雜交法測試，發現FIN219的C-端能與隱花色素cryptochrome1 (cry1) 及cryptochrome2 (cry2) 有交互作用；然而分別大量表現FIN219在cry1、cry2、或cry1cry2突變體中，轉殖株與遺傳背景植株都沒有顯著的外表型差異，推斷必須有CRY1及CRY2同時作用，才得以將藍光訊息傳遞給FIN219。此外，大量表現FIN219，可以使GUS-CCT1 (overexpression of GUS-CRY1 C-terminus) 轉殖株原本在黑暗中持續光型態發生外表型回復成具較長下胚軸，較接近暗型態發生的外表型，推測是由FIN219與GUS-CCT1的交互作用，而削弱了GUS-CCT1對COP1抑制能力，造成外表型的改變。 由microarray的資料顯示，在fin219突變體中有四個與乙烯相關的基因表現量上升，暗示FIN219可能可以調控乙烯的訊息傳遞。另外，cry1cry2雙突變株在黑暗中生長在含1 μM ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，乙烯合成的前驅物)的培養基中，會有對ACC較不敏感的外表型；大量表現FIN219在cry1cry2雙突變體中能回復其對ACC敏感的外表型；FIN219啟動子驅動的GUS活性測試，FIN219會受到ACC誘導而表現在擴大的頂點鉤區域中；此外，FIN219-GUS融合蛋白可能受ACC的誘導而自子葉、頂點鉤由維管束向下運送。在遠紅光下，甲基茉莉酸 (methyl jasmonic acid) 及生長素皆會影響FIN219的表現，顯示遠紅光造成的光型態發生可能還共同受到多種荷爾蒙的調控，而FIN219可能扮演居中調節的功能。FIN219 has been demonstrated to be involved in phytochromes A-mediated inhibition of hypocotyl elongation in far-red light (FR) and its overexpressed transgenic Arabidopsis seedlings display a hypersensitive phenotype under FR, blue and white light conditions, which suggests that FIN219 may play a role in blue light signaling. To explore this possibility, a yeast two-hybrid interaction approach was utilized to examine whether FIN219 can interact with blue light photoreceptors, cryptochrome 1 (cry1) and 2 (cry2). The result indicated that the C-terminus of FIN219 can interact with CRY1 and CRY2. As well, FIN219 overexpression in cry1, cry2, or cry1cry2 mutant backgrounds did not show obvious phenotype, which implies that FIN219 may function only in the presence of CRYs proteins. Overexpression of FIN219 in GUS-CCT1 transgenic plants can rescue the constitutive photomorphogenic phenotype of GUS-CCT1 in darkness, which indicates that the interaction between FIN219 and GUS-CCT1 may exclude the binding of GUS-CCT1 to COP1 Microarray data revealed that fin219 mutation resulted in the upregulation of 4 different ethylene signaling components. This findings lead us to test whether FIN219 regulates ethylene response or signaling. The FIN219 overexpression in the cry1cry2 mutant background can rescue the defect of cry1cry2 mutants in response to 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC, a precursor of ethylene). Histochemical GUS staining indicated that ACC induced FIN219 expression in the exaggerated apical hook. ACC might promotes the downward transport of FIN219-GUS fusion proteins. In addition, FIN219 promoter activity was regulated by the addition of methyl jasmonate and auxin under FR light, which indicates that the photomorphogenic phenotype triggered by FR may be the result of combinatory interactions among multiple hormones and FR, where FIN219 may play a vital function to fine tune the process.摘要 II Abstract II 縮寫表 IV 一、 導論 1 二、 光敏素 1 三、 隱花色素 2 四、 光型態發生的分子機制 4 五、 隱花色素與光敏素的交互作用 5 六、 乙烯 6 七、 研究目標 8 第二章 材料與方法 9 一、 植物材料與生長條件 9 二、 植物基因轉殖與篩選 9 三、 GUS活性分析 10 四、 西方墨點分析 10 五、 質體構築 10 六、 酵母菌雙雜交 12 第三章 結果 13 一、 FIN219OE轉殖株在藍光下的外表型 13 二、 以酵母菌雙雜交法檢測CRY1及CRY2與FIN219的交互作用 13 三、 在GUS-CCT1轉殖株中大量表現FIN219抑制其COP外表型 14 四、 FIN219大量表現在cry1cry2的轉殖株回復cry1cry2對ACC的敏感性 15 五、 ProFIN219::GUS 轉殖在野生型之轉殖株在不同光源之下與乙烯的關係 15 六、 ProFIN219::GUS轉殖株在遠紅光下與不同荷爾蒙間的調控關係 16 七、 ProFIN219::FIN219:GUS:3’UTR在黑暗中受到乙烯的調控 17 八、 實驗結果圖 18 第五章、討論 34 一、 FIN219在藍光訊息傳遞中的功能 34 二、 CRY1及 CRY2與FIN219的直接交互作用 35 三、 FIN219大量表現回復cry1cyr2對ACC的低敏感性 37 四、 FIN219的表現受乙烯調控 38 五、 FIN219表現的位置 39 六、 FIN219可能將光訊息導入乙烯調控的光型態發生 40 表一、FIN219啟動子序列分析 (PlantCARE) 42 第六章、參考文獻 43 附錄一、實驗步驟 49 一、 阿拉伯芥之無菌栽培 49 二、 PCR 49 三、 Gene cloning 51 七、 阿拉伯芥之轉殖及篩選 53 八、 蛋白質電泳與西方點墨法 56 九、 GUS活性分析 60 十、 酵母菌雙雜交 62 附圖一、光訊息傳遞路徑圖 65 附圖二、大量表現FIN219在野生型中造成對藍光的高度敏感性 663437252 bytesapplication/pdfen-USFIN219遠紅光藍光乙烯荷爾蒙阿拉伯芥頂點鉤far-red lightblue ligthethylenehormonesArabidopsisapical hookotherhttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/57989/1/ntu-94-R92b42022-1.pdf