陳力騏Chen, Richie L. C.臺灣大學:生物產業機電工程學研究所謝博全Hsieh, Po-ChuanPo-ChuanHsieh2010-05-052018-07-102010-05-052018-07-102008U0001-0207200814075900http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/180183將台灣種短趾和尚蟹(Mictyris brevidactylus Stimpson, 1858)施予1 M鹽酸處理去除蟹殼上的碳酸鈣等灰質(1 hr)，接著施予1 M氫氧化鈉處理分解蟹肉蛋白質後(2 hrs)，可由其背部甲殼取得顏色接近透明、天然的幾丁質皮膜。皮膜厚度約為20 um至50 um，含水率約為90%至98%，分子量在1000 kDa以上。透過機械性質測試發現和尚蟹幾丁質皮膜擁有的拉力強度(5.57 MPa)甚至優於厚度為120 um之Parafilm○R (4.39 MPa)，皮膜細微孔徑構造能成功阻隔待測溶液中如蛋白質高分子與帶電干擾物影響(例如：維生素C)，藉由循環伏安法與電化學阻抗分析結果得知，和尚蟹皮膜本身不具有電化學活性，亦能在不影響中性待測物質之質傳與擴散的前提下，有效地排除血清蛋白質非特異性吸附，保護電極表面。本研究欲利用和尚蟹幾丁質皮膜作為酵素固定化擔體物質，以架橋劑戊二醛(glutaraldehyde)固定化葡萄糖氧化酵素(glucose oxidase, EC 1.1.3.4)，架構高靈敏度葡萄糖電極與流動注射式葡萄糖生物感測器，並應用於檢測市售乳酸醱酵飲料之葡萄糖含量。另外也以相同手法固定化膽鹼氧化酵素(choline oxidase, EC 1.1.3.17)，組裝流動注射式膽鹼感測器，應用於篩選抗乙醯膽鹼酯酉每活性之天然物質(可作為抗阿茲海默症天然藥物)以及評估血清膽鹼酯酉每之活性(肝臟功能的一項重要指標)。實驗結果發現以和尚蟹酵素皮膜所組裝的生物感測器，其耐用度皆可達到兩個月以上，並且顯示出良好的感測器性能，包括葡萄糖或膽鹼之檢出上限、檢測極限、重複性、再現性等。Chitinous membranes from the dorsal part of Taiwanese soldier crabs (Mictyris brevidactylus Stimpson, 1858) were purified by a sequence of acid/base treatments (treated with 1 M HCl for 1 hr, and then with 1 M NaOH for 2 hrs). The thicknesses of the clear chitinous membranes were measured to be 20 um - 50 um, the moistures were 90% - 98%, and the molecular weights were estimated over than 1000 kDa. The natural membranes showed higher tensile strengths (5.57 MPa) than the laboratory-use thin film, Parafilm○R (4.39 MPa, 120 um in thickness). Moreover, the fine pore-sized structure of the membranes could effectively impede the diffusion of problematic biomacromolecule and charged interferents such as ascorbate through the membrane. Both the cyclic voltammetric curves and the electrochemical impedance curves revealed that the biomembrane was electrochemical inert, and the electrostatic interaction between positively charged amino groups on the surface of chitinous membrane and negatively charged human serum albumin particles could extensively reduce the electrode fouling by non-specific adsorption of serum proteins.Our study utilized the natural chitinous membrane as the supporting material for enzyme immobilization by a cross-linking reagent, glutaraldehyde. For glucose sensing, glucose oxidase (EC 1.1.3.4) was immobilized to construct a glucose sensing electrode, and a flow injection glucose biosensor. These two systems were successfully applied to evaluate the glucose content in commercial soft drinks and fermentation broths. For choline sensing, choline oxidase (EC 1.1.3.17) was immobilized to construct a flow injection choline biosensor, this system was proved to be useful in screening natural substances with acetyl cholinesterase inhibitory activities that may become potential neutraceuticals for preventing Alzheimer’s disease, and was also used to estimate serum cholinesterase activity, a useful clinical index for liver function.All the experimental results demonstrated the constructed biosensors were sensitive, reproducible, and durable to glucose or choline biosensing for at least two months.口試委員會審定書 i謝 ii文摘要 iii文摘要 iv錄 vi目錄 x目錄 xiii一章 前言 1.1和尚蟹與生物感測器 1.2和尚蟹幾丁質皮膜應用於膽鹼酯酉每活性測定 3二章 文獻探討 5.1和尚蟹 5.2幾丁質、幾丁聚醣 6.2.1幾丁質、幾丁聚醣之歷史 6.2.2幾丁質、幾丁聚醣之來源 6.2.3幾丁質、幾丁聚醣之結構與晶型 7.2.4幾丁質、幾丁聚醣之製備 9.2.5幾丁質、幾丁聚醣之物理化學特性 10.2.5.1溶解度 10.2.5.2去乙醯率 10.2.5.3分子量 11.2.6幾丁質、幾丁聚醣之產業應用 13.2.6.1農業及食品方面 13.2.6.2廢水處理方面 14.2.6.3生醫、生化科技方面 14.3生物感測器 16.3.1生物感測器之定義 16.3.2生物元件與感測器元件 16.3.3生物感測器之產業應用 17三章 實驗設備與方法 19.1實驗藥品與儀器設備 19.1.1實驗藥品 19.1.2實驗儀器設備 20.2和尚蟹幾丁質皮膜製備與物理化學性質量測 21.2.1和尚蟹幾丁質皮膜純化 21.2.2去乙醯化 24.2.3去乙醯率量測 24.2.4膜厚量測 24.2.5皮膜拉力強度及形變伸長量測試 24.2.6皮膜含水率量測 26.2.7皮膜分子量量測 26.2.8皮膜離子選擇性研究 26.2.9皮膜抗蛋白質非特異性吸附研究 27.2.9.1循環伏安分析 27.2.9.2電化學阻抗分析 27.2.10合成不同分子量與不同厚度之幾丁聚醣膜 28.3葡萄糖電極 29.3.1酵素固定化 29.3.2系統架設 30.3.3量測原理 31.3.4市售乳酸醱酵飲料之葡萄糖含量測定 31.4流動注射式電化學葡萄糖生物感測系統 32.4.1酵素固定化 32.4.2電化學流穿槽製作 32.4.3系統架設 33.4.4量測原理 34.4.5電極表面修飾 34.4.6葡萄糖比色法 34.5流動注射式電化學膽鹼生物感測系統 35.5.1酵素固定化 35.5.2電化學流穿槽製作 35.5.3系統架設 37.5.4量測原理 38.5.5乙醯膽鹼酯酉每抑制型生物感測器之研發 39.5.5.1乙醯膽鹼酯酉每阻害率評估 39.5.5.2篩選抗乙醯膽鹼酯酉每活性之天然物質 40.5.6血清膽鹼酯酉每生物感測器之研發 40.5.6.1血清膽鹼酯酉每活性評估 40.6毛細管電泳法 41四章 結果與討論 42.1和尚蟹幾丁質皮膜之物理化學性質 42.1.1去乙醯化作用對皮膜機械強度之影響 42.1.2去乙醯化作用對皮膜含水率之影響 45.1.3和尚蟹皮膜分子量研究 47.1.4不同分子量人工幾丁聚醣薄膜之性質 49.1.5不同厚度人工幾丁聚醣薄膜之性質 50.1.6皮膜離子選擇性研究 51.1.7皮膜抗蛋白質非特異性吸附研究 53.2葡萄糖電極 57.2.1系統pH值最佳化 57.2.2系統感測性能 59.2.3市售乳酸醱酵飲料之葡萄糖含量測定 62.3流動注射式電化學葡萄糖生物感測系統 63.3.1系統流速最佳化 63.3.2系統感測性能 65.3.3電極表面修飾 67.3.4系統準確度比對 68.4流動注射式電化學膽鹼生物感測系統 69.4.1緩衝溶液離子濃度最佳化 69.4.2系統pH值最佳化 71.4.3系統感測性能 73.4.4乙醯膽鹼酯酉每抑制型生物感測器 74.4.4.1乙醯膽鹼酯酉每阻害率量測 74.4.4.2溫度對乙醯膽鹼酯酉每阻害率之影響 76.4.4.3篩選抗乙醯膽鹼酯酉每活性之天然物質 78.4.5血清膽鹼酯酉每生物感測器 79.4.5.1血清膽鹼酯酉每活性測定 79.4.6毛細管電泳法量測血清膽鹼酯酉每活性 80.4.6.1 Benzoylcholine及benzoic acid紫外光光譜特性 80.4.6.2電泳液pH值對電泳分離效果之影響 82.4.6.3電泳液離子濃度對電泳分離效果之影響 83.4.6.4歐姆定律 84.4.6.5外加電壓對電泳分離效果之影響 85.4.6.6毛細管電泳分離最佳化條件 86.4.6.7血清膽鹼酯酉每活性測定 88.4.6.8系統比對 90五章 結論 91考文獻 92錄A 和尚蟹生態衛星定位調查 103.1和尚蟹生態衛星定位調查方法 103.2和尚蟹生態衛星定位調查結果 105.2.1和尚蟹棲地衛星定位點 105.2.2和尚蟹習性 106.2.3各棲地概況 108.2.3.1挖仔尾和尚蟹生態調查 108.2.3.2香山濕地和尚蟹生態調查 110.2.3.3竹南濕地和尚蟹生態調查 112.2.3.4高美濕地和尚蟹生態調查 114.2.3.5福寶濕地和尚蟹生態調查 116.2.3.6王功濕地和尚蟹生態調查 118.2.3.7好美里濕地和尚蟹生態調查 120.2.3.8七股濕地和尚蟹生態調查 122人簡歷 124application/pdf5498002 bytesapplication/pdfen-US和尚蟹幾丁質皮膜生物感測器葡萄糖氧化酵素膽鹼氧化酵素soldier crabchitinous membranebiosensorglucose oxidasecholine oxidase[SDGs]SDG3thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/180183/1/ntu-97-F91631003-1.pdf