沈立言臺灣大學：食品科技研究所游慧娟Yu, Hui-ChuanHui-ChuanYu2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/56380樟芝（Antrodia cinnamomea）為台灣特有之真菌類，非常稀少且珍貴，主要原因為其只生長在中高海拔之牛樟樹上且其子實體生長非常緩慢，難以人工培養。在傳統上，主要用於治療腹瀉、高血壓及肝癌等，另已有研究指出樟芝子實體具有抗癌及抗氧化活性。但由於子實體過於昂貴，且目前研究指出液態培養之樟芝菌絲體及發酵濾液具有抗癌、保肝、抗氧化、抗發炎與神經保護等作用，所以目前以發展液態培養之樟芝來取代其子實體之用途。此外，由於目前肺癌及肝癌為分別國人惡性腫瘤之第一、二位，因此本研究乃探討深層培養之樟芝菌絲體乙醇萃取物（ethanolic extract of mycelia of A. cinnamomea，EMA）處理人類肺癌（A549）及肝癌（SK Hep-1及HA 22T/VGH）細胞生長影響及其作用機轉。結果顯示，EMA可抑制A549、SK Hep-1（p53-positve）及 HA 22T/VGH（p53-deletion，HBsAg [+]）細胞生長，在處理48小時後，IC50分別為30.9、48.2及117.1 μg/ml。進一步以流式細胞儀分析EMA對於此三株細胞生長之抑制情形，結果顯示細胞週期分別停滯於S期（A549，40 μg/ml）、G0/G1期（SK Hep-1，20 μg/ml）及S期（HA 22T/VGH，160 μg/ml）。此外，以EMA處理A549 （80 μg/ml）、SK Hep-1 （80 μg/ml）及 HA 22T/VGH（160 μg/ml）24小時後，細胞皆進行細胞凋亡（apoptosis）（sub G1期增加）， DNA電泳結果也顯示DNA呈現片段化（DNA ladder）。此外，以螢光顯微鏡檢測結果顯示，EMA誘導此三株細胞進行細胞凋亡與caspase-3的活化有關。西方墨點法的結果亦顯示以EMA分別處理此三株細胞後，會促使細胞中caspase-3、caspase-9及PARP蛋白的表現量增加，抑制Bcl-2蛋白的含量，使得細胞中的Bcl-2/Bax的比例減少，誘導細胞走向細胞凋亡的現象。綜合以上結果顯示EMA是經由粒線體路徑來調控細胞凋亡相關蛋白之表現，進而誘導此三株細胞進行細胞凋亡。Antrodia cinnamomea is well-known as a traditional Chinese medicine in Taiwan. Because the growth rate of the natural A. cinnamomea in the wild is very slow, it is difficult to be cultured in green house. It is very expensive to obtain its fruiting bodies. Additionally, it might be a possible and economical way to utilize the submerged fermentation to produce the product of A. cinnamomea with stronger bioactivity. Previous researches have shown A. cinnamomea has many biological activities, such as anti-cancer activity, hepatoprotection, anti-oxidation, anti-inflammation, neuroprotection, and so on. In addition, lung and liver cancer are very common malignant tumors in Taiwan. This study was to investigate the effect of ethanolic extract of mycelia of A. cinnamomea (EMA) in submerged fermentation on the human lung (A549) and liver (SK Hep-1 and HA 22T/VGH) cancer cell lines and their possible mechanisms. The results showed that EMA inhibit the cell viability of A549, SK Hep-1 (p53-positive) and HA 22T/VGH (p53-deletion, HBsAg [+]) for 48hr, and their IC50 value were 30.9、48.2 and 117.1 μg/ml, respectively. The results of cell cycle analysis showed that EMA induced cell cycle arrest in S (A549, 40 μg/ml), G0/G1 (SK Hep-1, 20 μg/ml) and S (HA 22T/VGH, 160 μg/ml) phase. Furthermore, EMA induced apoptosis (accumulation of sub G1 phase) in A549 (80 μg/ml), SK Hep-1 (80 μg/ml) and HA 22T/VGH (160 μg/ml), and the DNA ladder were presented in these three cell lines by DNA electrophoresis. According to the results of fluorescence microscope, it indicated that EMA induced A549, SK Hep-1 and HA 22T/VGH apoptosis through induction of caspase-3 activity. It also indicated that EMA increased caspase-3 and -9 and PARP proteins expression, and decreased the Bcl-2 protein expression and the ratio of Bcl-2/Bax of A549, SK Hep-1 and HA 22T/VGH. In conclusion, EMA could induce these three cell lines apoptosis through mitochondrial pathway by regulating the expression of apoptosis-related proteins.摘要 I Abstract II 目錄 IV 表次 VI 圖次 VII 壹、 前言 1 貳、 文獻回顧 4 一、 癌症 4 （一）癌症 4 （二）肝癌簡介 5 （三）肺癌簡介 10 二、 實驗用材料-樟芝 14 （一）樟芝之簡介 14 （二）成分分析 15 （三）樟芝之保健功效 21 三、 細胞週期、細胞凋亡與細胞壞死 24 （一）細胞週期（cell cycle） 24 （二）細胞凋亡的機轉 31 參、 研究目的與實驗架構 39 一、 研究目的 39 二、 實驗架構 41 肆、 實驗材料與方法 42 一、 實驗材料 42 二、 實驗細胞株 42 （一）人類肺癌細胞株A549 42 （二）人類肝癌細胞株SK Hep-1 42 （三）人類肝癌細胞株HA 22T/VGH 42 三、 化學藥品與溶劑 42 四、 儀器設備 45 （一）樣品前處理與萃取用儀器 45 （二）細胞培養用儀器 45 （三）樣品分析用儀器 46 五、 實驗方法 47 （一）樣品之前處理與製備 47 （二）細胞培養 47 （三）細胞存活率分析-MTT assay 49 （四）細胞形態觀察 50 （五）細胞週期分析 50 （六）DNA片段化測定 50 （七）Caspase-3活性之分析 51 （八）西方墨點法-Western blot assay 52 六、 統計分析 56 伍、 結果 57 一、 樟芝菌絲體乙醇萃取物（EMA）對人類肺癌細胞株A549影響 57 （一）細胞存活率之影響 57 （二）細胞形態之影響 57 （三）細胞週期之影響 57 （四）DNA片段化的影響 58 （五）Caspase-3活性的影響 59 （六）細胞凋亡相關蛋白表現量之影響 60 二、 樟芝菌絲體乙醇萃取物（EMA）對人類肝癌細胞株SK Hep-1影響 60 （一）細胞存活率之影響 60 （二）細胞形態之影響 61 （三）細胞週期之影響 61 （四）DNA片段化的影響 62 （五）Caspase-3活性的影響 62 （六）細胞凋亡相關蛋白表現量之影響 62 三、 樟芝菌絲體乙醇萃取物（EMA）對人類肝癌細胞株HA 22T/VGH影響 63 （一）細胞存活率影響 63 （二）細胞形態之影響 64 （三）細胞週期之影響 64 （五）Caspase-3活性的影響 65 （六）細胞凋亡相關蛋白表現量之影響 65 陸、 討論 67 柒、 結論 72 捌、 圖表 73 玖、 參考文獻 97 附錄 1071925173 bytesapplication/pdfen-US樟芝發酵菌絲體細胞週期停滯細胞凋亡肝癌肺癌Antrodia cinnamomeafermentationmyceliacell cycle arrestapoptosishepatocellular carcinomalung cancer[SDGs]SDG3thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/56380/1/ntu-95-R93641001-1.pdf