蔣丙煌臺灣大學：食品科技研究所劉佩柔Liu, Pei-JouPei-JouLiu2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/56378本研究以當歸水萃物為原料，區分為小分子 (< 300 Da)及大分子 (> 300 Da，酒精沉澱粗多醣)，以探討當歸是否具有傳統中國醫藥所稱之「補血」功效。本研究以 in vitro及 in vivo兩種方式進行。前者利用取自小鼠之造血幹細胞進行實驗，觀察樣品是否有刺激血球細胞集落增生之效果；後者則以急性失血性貧血的動物模式 (BALB/c小鼠)探討當歸區分物對造血功能之影響。 研究結果發現，當歸水萃物中小分子成分不具有刺激血球細胞集落數增加的效果。但是，以大分子之多醣先行刺激脾臟細胞，產生條件培養液，再以含細胞激素之條件培養液刺激造血幹細胞，則能顯著的增加血球細胞集落數 (p < 0.05)。所形成的集落的集落型態主要有顆粒球集落 (granulocytic colony)、顆粒球-單核 (granulocyte and monocyte colony)及顆粒球-巨噬細胞混合型集落 (granulocyte and macrophagic colony)。最後，在以動物模式評估造血功能方面，發現當歸粗多醣並不會影響小鼠正常生長情形以及主要器官之重量；低劑量時，當歸粗多醣顯著提升失血後小鼠之血紅素值 (p < 0.05)；低、高劑量皆具有刺激脾臟細胞增生的能力 (p < 0.05)，並且於高劑量組中可顯著增加細胞激素 GM-CSF及 IL-6 (p < 0.05)；最後，低、高劑量皆可顯著的增加集落數目 (p < 0.05)。Angelica sinensis (Oliv.) Diels is a well-known herb belonging to family Umbelliferae, and is traditionally used for the treatment of anemia. The aim of this study was to investigate hematopoietic effect of extracts of Angelica sinensis (AS). For in vitro studies, the hematopoietic stem cells, collected from BALB/c mice were treated with AS, to observe the colonies-forming activity. For in vivo studies, acutely bleed BALB/c mice were administered polysaccharides which were precipitated with EtOH (ASPS) orally, to assess the hematopoietic activity of Angelica sinensis extracts. The AS extract was subjected to membrane filtration using hollow fiber membrane module with molecular weight cut-off of 300 Da. Spleen cells from mice was treated with the permeate containing components of AS with molecular weight less than 300 Da (ASsp) and the AS polysaccharides which were precipitated with EtOH from the retentate (ASPS). Then, the spleen condition medium (ASsp-SCM, ASPS-SCM) was collected. It was found that the ASsp-SCM could not promote colony-forming in bone marrow cells. However, bone marrow cells treated with ASPS-SCM showed significant (p < 0.05) increase in colony formation as compared to AS-SCM and ASsp-SCM. Morphologic analysis of the colonies formed by ASPS-SCM showed three cell types, including granulocytes, granulocytes /monocytes and granulocytes /macrophages. The result of in vivo study showed that, the low dose of ASPS significantly (p < 0.05) increased the production of hemoglobin, while the high dose of ASPS significantly (p < 0.05) increased the levels of GM-SCF and IL-6 as compare with control and low dosage. Also it was observed that the high dose of ASPS significantly (p < 0.05) proliferated spleen cells. This herbal medicine activates immature blood cells, possibly by suppressing cytokine secretion, thereby promoting hematopoiesis. Thus the in vitro and in vivo studies have proved that Angelica sinensis has significant hematopoietic and proliferative activity and can be used in anemia treatment.目錄 頁碼 中文摘要…………………………………………………………………………………I 英文摘要…………………………………………………………………………. ….....II 目錄…………………………………………………………………………………….IV 表目錄…………………………………………………………………………….. .....VII 圖目錄………………………………………………………………………………..VIII 第一章、 研究動機與目的………………………….…………………………………1 第二章、 文獻回顧………………………………….…………………………………2 ㄧ、 當歸簡介……………………………………….………………………………..2 (ㄧ) 當歸的主要成分…………………………….………………………………..3 (二) 當歸阿魏酸及揮發性成分的藥理作用…….………………………………..4 (三) 當歸多醣的藥理作用……………………….………………………………..5 二、 造血功能簡介………………………………….………………………………...6 (ㄧ) 何謂造血、造血幹細胞…………………….………………………………..6 (二) 造血系統 …………………………………….………………………………7 1. 造血器官…………………………………………………………………..7 2. 血球形成…………………………………………………………………..8 (三) 造血幹細胞分化途徑……………………………………………………….10 (四) 造血生長因子種類………………………………………………………….11 (五) 造血功能評估-體外培養功能性之評估 (in vitro culture functional assay)……………………………………………………..………………...14 1. 集落形成分析 (Colony-forming unit assay, CFU assay) ………………14 2. 原始細胞長期培養 (Long-term culture initiating cell assay, LTC-IC assay)...……………..……………………………………………………15 三、 貧血………………………………………………………….………………….16 (一) 貧血的定義………………………………………………………………….16 (二) 貧血的主因………………………………………………………………….16 (三) 貧血的種類………………………………………………………………….17 (四) 血虛動物模式……………………………………………………………….18 四、 膜分離技術……………………………………………………………………..20 (一) 膜的選擇…………………………………………………………………….20 (二) 膜組件……………………………………………………………………….21 (三) 進行區分…………………………………………………………………….23 第三章、 當歸萃取成分造血功能評估-體外試驗…………………………………..24 ㄧ、 實驗設計………………………………………………………………………..24 二、 材料與方法……………………………………………………………………..26 (一) 材料與藥品…………………………………………………………………26 (二) 儀器設備……………………………………………………………………28 (三) 實驗方法……………………………………………………………………30 1. 實驗樣品之製備…………………………………………………………30 1-1 製備當歸水萃液…………………………………………………….30 1-2 以膜分離製備當歸水萃液區分物………………………………….30 2. 當歸總醣含量的測定……………………………………………………31 3. 當歸成份造血功能評估…………………………………………………31 3-1 製備小鼠脾臟條件培養液 (Murine spleen cell-conditioned medium, SCM) ……………………………………………………………….31 3-2 製備小鼠肺臟條件培養液 (Murine lung cell-conditioned medium, LCM) ……………………………………………………………….32 3-3 集落生成分析 (Colony-forming assay) ……………………………32 4. 細胞毒性評估……………………………………………………………33 5. 劑量、作用方式及不同刺激天數對造血功能影響……………………33 6. 細胞激素含量測定………………………………………………………34 7. 集落型態觀察……………………………………………………………35 8. 統計分析…………………………………………………………………35 三、 結果與討論……………………………………………………………….……36 (一) 當歸水萃液不同區分物之造血功能評估………………………………...36 (二) 細胞毒性的評估…………………………………………………………...37 (三) 劑量、作用方式及不同刺激天數對造血功能影響………………………37 (四) 集落型態觀察……………………………………………………………...40 第四章、 以動物模式探討當歸粗多醣 (ASPS) 對造血功能的影響……………….49 一、 實驗設計……………………………………………………………………….49 二、 材料與方法…………………………………………………………………….50 (一) 材料與藥品………………………………………………………………...50 (二) 儀器設備…………………………………………………………………...52 (三) 實驗方法…………………………………………………………………...54 1. 動物飼養………………………………………………………………....54 2. 實驗分組…………………………………………………………………54 3. 實驗過程(失血性貧血小鼠)………………………………..……………54 3-1 體重紀錄……………………………………………………….…...55 3-2 血紅素濃度測定……………………………………………………55 3-3 臟器收集……………………………………………………………56 3-4 集落生成分析………………………………………………………56 3-5 脾臟細胞計數………………………………………………………57 3-6 細胞激素含量測定…………………………………………………57 3-7 統計分析……………………………………………………………58 三、結果與討論……………………………………………………………………...59 (一) 飼養期間體重以及犧牲後各主要器官重量變化………………………...59 (二) 血紅素濃度測定……………………………………………………….…..59 (三) 集落形成試驗………………………………………………………….…..60 (四) 脾臟細胞數目………………………………………………………….…..61 (五) 細胞激素含量測定………………………………………………….……..61 第五章、 結論………………………………………………………………………...70 參考文獻…………………………………………………………………….…………71 附錄…………………………………………………………………………………….76 表目錄 表 2-1. 各生長期的造血位置。…………………………………………………….…8 表 2-2. 造血生長因子。……………………………………………………………...14 表 3-1. 當歸水萃液不同區分物之脾臟細胞條件培養液 ASPS-SCM、 AS-SCM及 ASsp-SCM對骨髓細胞集落形成的影響。……………………..…….……42 表 4-1. BALB/c小鼠經急性失血後餵食當歸粗多醣各主要器官之重量變化。…....64 表 4-2. BALB/c小鼠經急性失血後餵食當歸粗多醣之集落形成作用。………...…66 表 4-3. BALB/c小鼠經急性失血後餵食當歸粗多醣之脾臟細胞數變化。……..…..67 表 4-4. BALB/c小鼠經急性失血後餵食當歸粗多醣造血成長因子，GM-CSF 以及 M-CSF 之測定。………………………………………………………….…68 表 4-5. BALB/c小鼠經急性失血後餵食當歸粗多醣造血成長因子，IL-6 以及 IL-3之測定。…..…………………………………………………………………….….69 圖目錄 圖 2-1. 當歸………………………………………………………………………….…2 圖 2-2. a.稁本內酯 (ligustilide) 及 b.阿魏酸 (ferulic acid) 的結構式。……………4 圖 2-3. 造血幹細胞的分化途徑。……………………………………………………11 圖 2-4. 中空纖維膜分離的原理。……………………………………………………22 圖 2-5. 中空纖維膜的膜組件。………………………………………………………22 圖 3-1. ASPS對小鼠脾臟細胞存活率之影響。…………………………………..…43 圖 3-2. 以不同作用濃度的 ASPS 及刺激方式對骨髓細胞集落形成的影響。..…44 圖 3-3. 將 ASPS 以間接方式刺激脾臟細胞三天及五天後 ASPS-SCM 對骨髓細胞集落形成的影響。…………………………………………………..…..…45 圖 3-4. ASPS-SCM 刺激脾臟細胞三天及五天之條件培養液中造血成長因子 GM-CSF及 M-CSF含量測定。…………………………………………..…46 圖 3-5. ASPS-SCM 刺激脾臟細胞三天及五天之條件培養液中造血成長因子 IL-6及 IL-3含量測定。………………………….……………………………..…47 圖 3-6. 集落的型態(顯微鏡於 250倍下觀察所拍攝)。(A) 顆粒球，(B) 顆粒球-單核球混合型，(C) 顆粒球-巨噬細胞混合型。……………..………….……48 圖 4-1. BALB/c小鼠經急性失血後餵食當歸粗多醣體重之變化。………….….…63 圖 4-2. BALB/c小鼠經急性失血後餵食當歸粗多醣血紅素值之變化。…….…….65908562 bytesapplication/pdfen-US當歸粗多醣 (ASPS)脾臟細胞條件培養液造血功能集落數急性失血細胞激素Angelica sinensis polysaccharide (ASPS)spleen cell-conditioned medium (SCM)hematopoietic activitycolony-forming assayacutely bleedcytokine.thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/56378/1/ntu-96-R94641018-1.pdf