朱瑞民臺灣大學：獸醫學研究所林奕君Lin, Yi-ChunYi-ChunLin2007-11-282018-07-092007-11-282018-07-092007http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/59993NK ( Natural killer ) 細胞為先天性免疫反應中重要的一員，可快速有效的認識並清除受病毒感染之細胞和腫瘤細胞，此細胞之活化主要是來自表面抑制型接受器和活化型接受器的信息調控，現今在許多物種中已有很多不同種類之NK細胞接受器被發現，如KIR, NCRs, ILT/ILR, 2B4, CD94/NKG2, NKG2D, Ly49, NKR-P1等等。但是目前為止，和犬NK細胞表面抗原或表面接受器相關的文獻非常有限，而本論文利用RT-PCR、3’RACE和DNA定序等方式，第一個於犬PBL和LAK中鑑定出NKp30 mRNA，犬NKp30結構和人類及大鼠之NKp30類似。我們同時在犬PBL和LAK中，利用flow cytometer鑑定出一群CD8+ 細胞表現T細胞抗原，包括CD3和α/βTCR，且由real-time PCR的結果證實此細胞群含有較高之NK細胞接受器或抗原之mRNA之表現，如NKp30、NKp44、NKG2D、2B4、CD16和CD56，且這一群細胞具有較CD8-細胞為高的NK細胞毒殺能力。此群細胞未在其他動物包括人類被報告過，為犬血液中特有之細胞。Natural Killer (NK) cells are important effectors of the innate immune response. The function of NK cells is regulated by a balance between signals transmitted by activating and inhibitory receptors. Many types of inhibitory and activating NK cell receptors in the mammals have been identified, such as KIR, NCRs, ILT/ILR, 2B4, CD94/NKG2, NKG2D, Ly49, NKR-P1, and others. As for canine species, very little information is available on the inhibitory or activating NK receptors responsible for triggering natural cytotoxicity. In this study, we have identified and sequenced the full length of canine NKp30 mRNA from dog PBL and LAK. We have also discovered a subset of canine CD8+ cells from PBL and LAK that expressed CD3 and TCR a/b, containing higher NKp30 and other NK cell-related receptors mRNA than CD8- cells, including NKp44, NKG2D, 2B4, CD16 and CD56. This subset showed significantly higher NK activity comparing to CD8- cells. This subset has never been reported in other mammals, including human. It is a unique subset of cells in dogs. This finding is useful for the study on canine NK cell receptors.目 錄 口試委員會審定書•••••••••••••••••i 致謝••••••••••••••••••••••••••ii 中文摘要••••••••••••••••••••••••iii 英文摘要••••••••••••••••••••••••iv 圖次•••••••••••••••••••••••••••v 表次•••••••••••••••••••••••••••vii 縮寫符號••••••••••••••••••••••••viii 第一章 緒言•••••••••••••••••••••••1 第二章 文獻探討••••••••••••••••••••••2 第一節 自然殺手細胞••••••••••••••••2 一、 NK細胞在先天免疫反應中扮演的角色••••••2 二、 NK細胞之發展及成熟••••••••••••2 三、 NK細胞的功能•••••••••••••••3 四、 NK細胞和後天免疫反應的關係•••••••••4 五、 NK細胞對抗腫瘤細胞的機制••••••••••4 六、 NK細胞對抗病毒感染之機制••••••••••5 七、 NK細胞其他方面的功能•••••••••••6 第二節 自然殺手細胞接受器•••••••••••••8 一、 自然殺手細胞接受器之調控••••••••••8 1. 活化型接受器•••••••••••••••8 2. 抑制型接受器•••••••••••••••9 二、 自然殺手細胞接受器的種類•••••••••11 1. KIR•••••••••••••••••••11 2. Ly49•••••••••••••••••••12 3. CD94/NKG2 family••••••••••••12 4. NKG2D••••••••••••••••••13 5. 2B4•••••••••••••••••••13 6. LIR/ILTs family••••••••••••••14 7. CD16和CD56•••••••••••••••15 8. LAIR、IRp60 和 p75 / AIRM1••••••••••16 第三節 NKp30•••••••••••••••••••18 一、 自然毒殺型接受器••••••••••••••18 二、 NKp30••••••••••••••••••19 1. NKp30基本特性之相關研究••••••••••19 2. NKp30之受體••••••••••••••••20 3. NKp30和後天免疫反應的關係•••••••••21 三、 NKp44、NKp46和NKp80••••••••••••22 1. NKp46•••••••••••••••••••22 2. NKp44••••••••••••••••••22 3. NKp80••••••••••••••••••23 第四節 犬自然殺手細胞•••••••••••••••24 一、 犬自然殺手細胞之特性••••••••••••24 二、 犬自然殺手細胞的備製••••••••••••24 三、 犬自然殺手細胞活性的測試••••••••••25 四、 犬自然殺手細胞表面抗原或表面接受器•••••26 五、 犬自然殺手細胞和犬傳染性花柳性腫瘤及其它型態之腫瘤的關係••••••••••••••••27 第五節 NKT細胞•••••••••••••••••29 一、 NKT 細胞的定義•••••••••••••••29 二、 NKT 細胞表面抗原及接受器••••••••••29 三、 NKT 細胞的活化及其受體•••••••••••30 第六節 結論•••••••••••••••••••31 第三章 實驗目標•••••••••••••••••••••32 第四章 材料與方法••••••••••••••••••••33 第一節 犬各種細胞的取得•••••••••••••33 一、 實驗動物••••••••••••••••••33 二、 犬週邊血液淋巴球之純化•••••••••••33 三、 犬淋巴激素活化殺手細胞的取得•••••••34 四、 分離犬 PBL 和 LAK 細胞中之 CD8+ 及CD8- 細胞群•••••••••••••••••••••34 第二節 犬NKp30基因序列的鑑定分析•••••••••35 一、 犬NKp30引子設計••••••••••••••35 二、 犬NKp30基因序列的鑑定和分析••••••••35 1. 細胞中RNA的純化••••••••••••••35 2. 反轉錄聚合酶連鎖反應••••••••••••35 3. 快速增幅3端cDNA序列法•••••••••••36 4. PCR產物之純化•••••••••••••••37 5. 基因選殖•••••••••••••••••37 6. 質體DNA之分離和定序••••••••••••38 7. 限制酶切位反應•••••••••••••••39 8. 犬NKp30基因序列之比對和分析••••••••39 第三節 犬 CD8+ 細胞之特性•••••••••••••40 一、 流式細胞分析儀•••••••••••••••40 二、 Real - time PCR••••••••••••••••40 三、 NK細胞毒殺能力測試•••••••••••••41 1. CTAC killing assay••••••••••••••41 2. K562 killing assay•••••••••••••••41 第五章 結果•••••••••••••••••••••••44 第一節 犬NKp30基因的鑑定••••••••••••44 一、 犬NKp30部分基因的預測及鑑定••••••••44 二、 犬NKp30全長基因序列的鑑定•••••••••50 三、 犬NKp30之基因及蛋白質序列和其他物種之比較•55 第二節 NKp30及CD8和犬NK細胞的關係•••••••57 第六章 討論••••••••••••••••••••••• 74 第七章 參考文獻•••••••••••••••••••••811067215 bytesapplication/pdfen-US犬自然殺手細胞周邊血液淋巴球淋巴激素活化殺手細胞自然毒殺型接受器3 (NKp30, NCR3)CD8自然毒殺作用canine natural killer cellsperipheral blood lymphocytes (PBL)lymphokine - activated killers (LAK)natural cytotoxicity receptor 3 (NCR3, NKp30)natural cytotoxicitythesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/59993/1/ntu-96-R92629012-1.pdf