孫璐西臺灣大學:食品科技研究所何承璋Ho, Cheng-ChangCheng-ChangHo2010-05-112018-06-292010-05-112018-06-292009U0001-0302200916275600http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/182188摘要口老化與伴隨而來的退化性疾病（degenerative diseases）為已開發國家所面臨的共通問題。「老化」是人類正常發育的一個階段，乃隨著年齡增加，逐漸累積體內的一些變化，而這些變化將提高對疾病或死亡的敏感性。阿茲海默症（Alzheimer’s disease, AD）為一漸進性的神經退化性疾病，為65歲以上老年人最常發生之失智症（dementia）。研究之目的在於評估中國傳統食藥材對延緩老化與預防或延緩AD進程之功效。藉合適的AD研究模式--「Aβ1-40聚集導致PC-12細胞氧化凋亡之抑制」與老化研究模式--「線蟲壽命延長」，並以國內外廣被使用的銀杏葉萃出物（Ginkgo biloba extract, EGb 761）和丹參酚酸B（salivianolic acid B, Sal B）作為抗阿茲海默症模式之正對照組，以Eukarion-8 (EUK-8)作為抗老化模式之正對照組，實驗材料為中醫藥理論與現代研究中皆指向具抗老化功效之食藥用保健素材，包括人參、天麻、甘草、當歸、赤芍、枸杞子、芝麻、何首烏和桑椹等。篩選出三個具有顯著抑制Aβ的神經毒性與延緩線蟲老化功效之食藥材，分別為當歸、何首烏和天麻。接著將此三種食藥材以甲醇萃取與溶劑區分，得其甲醇粗萃物之乙酸乙酯層區分物、正丁醇層區分物以及水可溶物。以「Aβ1-40聚集導致分化的（differentiated）PC-12（dPC-12）細胞氧化凋亡之抑制」與「線蟲壽命延長」兩模式進行活性評估，同樣以EGb 761、Sal B與EUK-8作為兩模式之正對照組。選出活性最高之溶劑區分物--當歸甲醇粗萃物之乙酸乙酯層區分物（AS-M-EA），將其進行矽膠管柱層析，取得不同極性之沖提區分，以「Aβ1-40聚集導致dPC-12細胞氧化凋亡之抑制」進行活性評估，選出fraction 3 (F3)、fraction 4 (F4)與fraction 9 (F9)等三個最具抑制Aβ1-40聚集物神經毒性之管柱區分物。探究三者抑制aggregated Aβ1-40 (agg Aβ1-40)毒性之可能機制，發現F3、F4與F9三個區分，皆能減輕因agg Aβ1-40導致的dPC-12細胞內ROS與鈣離子含量上升，及粒線體膜電位下降等現象。此外，藉thioflavin T assay與atomic force microscopy (AFM) 掃描亦發現，三者皆能顯著破壞Aβ1-40聚集物的結構，且效果為F4>F9>F3。而F9除能降低β-sheet的結構外，本身也具有優越的抗氧化活性。3、F4與F9三者也能延長N2、mev-1與daf-2線蟲之平均壽命與最大壽命，其中以F4的影響最為顯著。但F3與F9對N2及mev-1線蟲體內SOD活性的影響較顯著，且只有F9能延長線蟲子代之SOD活性。進一步以daf-16線蟲探討F3、F4與F9延長線蟲壽命之機制，發現F3延長壽命的效果大幅減低，F4則無法顯著延長daf-16線蟲壽命，僅F9仍能顯著延長daf-16線蟲壽命(但影響較其對N2線蟲小)，顯示F3與F4延長線蟲壽命的機制與daf-16有密切的關係，而F9延長線蟲壽命之影響可能主要與其抗氧化活性有關。生物活性作為分離與純化依據 ( bioactivity guided isolation and purification)，從當歸中分離出ferulic acid與coniferyl ferulate為F9中的主要活性物質，其具有很好的抗氧化與破壞Aβ聚集結構之活性，並能顯著抑制agg Aβ1-40對dPC-12細胞之傷害。此外，F4中的兩個主要活性化合物Z-ligustilide與11-angeloylsenkyunolide F皆能顯著抑制agg Aβ1-40對dPC-12細胞之傷害，但並無法破壞Aβ聚集之結構，有關F4中主要破壞Aβ聚集物的活性成分還需再繼續研究。Abstractging of population and the accompanying degenerative disorders are the common problems in developed countries. “Aging” is part of normal human development. It is defined as the progressive accumulation of changes with time that are associated with or responsible for the ever-increasing susceptibility to disease and death which accompanies advancing of age. Alzheimer’s disease (AD) is a progressive, neurodegenerative disorder which is the most common cause of dementia in people aged over 65. he aim of this study is to evaluate the potential of the traditional Chinese herbal medicines to delay aging or the progress of AD. We used the “ Inhibition of aggregated Aβ-induced PC-12 cells death” as the “anti-Alzheimer’s disease” model, and the “Extension of nematode''s life-span” as the “anti-aging” model. In the anti-Alzheimer’s disease model, we used the standardized extract from the leaves of the Ginkgo biloba tree（EGb 761） and salivianolic acid B（Sal B）as the positive controls. In the anti-aging model, we used Eukarion-8 (EUK-8) as the positive control. The Chinese herbal medicines under investigation were Panax ginseng C. A. Mey.、Gastrodia elata Blume、Glycyrrhiza uralensis Fisch.、Angelica sinensis (Oliv.) Diels、Paeonia veitchii Lynch、Lycium chinense Miller、Sesamum indicum L.、Polygonum multiflorum Thunb. and Morus alba L. In the initial screening, Angelica sinensis, Polygonum multiflorum and Gastrodia elata showed superior biological activity. The ground powders of these three traditional Chinese herbal medicines were extracted with methanol. Then the methanol extracts were partitioned between ethyl acetate / water and n-butanol / water in succession, ethyl acetate, n-butanol and aqueous fractions of each methanol extract were obtained. After removing the solvents under vacuum, each solvent fraction was tested for its activities by “Inhibition of aggregated Aβ-induced differentiated PC-12 (dPC-12) cells death ” and “Extension of nematode''s life-span ” models. EGb 761/Sal B and EUK-8 were again used as the positive controls, respectively. We found that ethyl acetate fraction of the methanol extract of Angelica sinensis (AS-M-EA) was the most biologically active fraction. S-M-EA was separated by silica gel column chromatography with n-hexane (H) / ethyl acetate (EA) mixture as the gradient elution solvent system. I obtained three extremely active fractions, fraction 3 (F3), fraction 4 (F4) and fraction 9 (F9), which inhibited approximately half of the cytotoxicity induced by Aβ at a concentration of 100 μg/ml (inhibited 50.5, 50.0 and 49.5% agg Aβ1-40-induced cytotoxicity, respectively). The possible mechanisms of these fractions to reduce agg Aβ1-40-induced cytotoxicity were further investigated. Our results showed that F3, F4 and F9 significantly reversed the agg Aβ1-40-induced neurotoxicity by attenuating the elevation of ROS level and intracellular [Ca2+], and the decline of mitochondrial membrane potential. We found these fractions also destroyed the structure of Aβ aggregates in thioflavin T and atomic force microscopy (AFM) assays, and the disaggregation effects decreased in the following order: F4>F9>F3. These three fractions could extend the life-span of N2 (wild type C. elegans), mev-1 mutant and daf-2 mutant. But only F9 elevated SOD activity in the filial generation. In daf-16 mutant, only F9 showed a significant lifespan-extending effect. This may suggest that the mechanism of F3 and F4 to prolong nematode''s life-span is through insulin/IGF-1 signaling pathway（IIS pathway）and is DAF-16 involved.ioassay-guided fractionation and purification processes were employed to identify the active compounds from the root of Angelica sinensis. Four compounds showing potent activities were identified by comparing spectral data (UV, NMR, and ESI-MS) with literature values to be z-ligustilide, 11-angeloylsenkyunolide F, coniferyl ferulate and ferulic acid. They were found to significantly inhibit Aβ1-40 toxicity on dPC-12 cells at lower concentrations (1~10 µg/mL), but they were toxic to the dPC-12 cells at high concentrations (> 50 µg/mL). Coniferyl ferulate and ferulic acid were found in F9 and displayed a strong effect on antioxidant and Aβ disaggregation activities. Z-ligustilide and 11-angeloylsenkyunolide F, which existed in F4, displayed a strong inhibition effect on Aβ-induced cytotoxicity but weak effect on antioxidant and Aβ disaggregation activities. Thus the mechanism of these phthalides to reduce Aβ1-40-induced toxicity in dPC-12 cells needs further investigation.摘要………………………………………………………………………………… Ⅰ錄………………………………..………………………………….……………. Ⅵ次……………………………………………………………….………………... ⅩⅢ次…………………………………………………….……………….………….. ⅩⅧ寫表………………………………………………………….….……………….. ⅩⅩⅠ. 前言……………………………………………………...……………...….…. 1. 文獻整理……………………………………………………………………… 3、失智症 (Dementia)與阿茲海默症(Alzheimer’s disease, AD)……………. 3 (1) 血管病變性失智症 (vascular dementia, VaD)……………………….. 3 (2) 額顳失智症 (frontotemporal dementia, FTD)………………………. 43) Lewy body 失智症(dementia with Lewy body, DLB)………………… 5 (4) 阿茲海默症(Alzheimer’s disease, AD)………………………..….…… 6、阿茲海默症的發展與病理特徵…………………………………………… 7、阿茲海默症的病理機制………………………………………….…….….. 101）β-類澱粉胜肽 (β-amyloid peptide; Aβ)………………..…….…...…. 102）Tau……………………………………….………..…….…….……….. 183）脂蛋白元 E (Apolipoprotein E; apoE).................................................... 214）早衰蛋白（Presenilin, PS）.................................................................... 21、氧化壓力(Oxidative stress) 與神經退化性疾病的關係………….............. 23、阿茲海默症之危險因子………………………………………………….... 23amp;#63953;、 阿茲海默症的治療處理…………………………………………………… 261）降低 Aβ 於腦部的聚集……………………………………………………... 272）抑制 cholinesterase 的活性…………………………………………….. 283）抗氧化劑與金屬螯合劑……………………………………………….. 284）降血脂藥物…………………………………………………………….. 29、飲食中的抗氧化劑與神經退化性疾病的關係………………….………… 29、PC-12 細胞模式與阿茲海默症的研究……………………………………. 30、研究阿茲海默症之動物模式………………………………………………… 31一）基因轉殖小鼠（Transgenic mice, Tg mice）…………………………….. 31二）基因轉殖線蟲（Transgenic C. elegans, Tg C. elegans）………………... 33三）易快速老化小鼠 (Senescence-accelerated prone mouse, SAMP)……. 35、 老化學說………………………………………………………………........ 37 (1)程序性老化理論（Programmed theories）或稱預設老化理論…………… 38 (2)錯誤理論（error theories）或稱 DNA 破壞理論 (DNA Damage Theories) 42一、線蟲（Caenorhabditis elegans）與老化研究………………………………. 43一）線蟲簡介與環境對線蟲壽命之影響…………………..…………….. 43二）調控線蟲壽命之基因與相關之基因突變線蟲……………………… 44二、現代中醫與老化…………………………………………………………… 48三、本研究之實驗材料介紹…………………………………………………… 49一）銀杏葉萃出物（EGb 761）………………………………………….. 49二）丹參酚酸 B（Salvianolic acid B, Sal B）…………………………... 52三）赤芍（Paeonia veitchii）……………………………………………. 53四）天麻（Gastrodia elata）…………………………………………….. 54五）人參（Panax ginseng）………………………………………............ 55六）當歸（Angelica sinensis）…………………………………………… 55七）何首烏（Polygonum multiflorum）………………………………….. 56八）枸杞子（Lycium barbarum）………………………………………... 57九）桑椹（Morus alba）…………………………………………………. 58十）甘草（Glycyrrhiza uralensis, Gancao）……………………………... 58十ㄧ）芝麻 (Sesame)……………………………………………………. 59amp;#63851;. 研究目的與實驗架構……………………………………………….................. 60、研究目的…………………………………………………………………... 60、實驗架構…………………………………………………………………… 62.具抗阿茲海默症與延緩衰老功效之食藥材篩選………………………. 62. 有效食藥材之溶劑區分與功效評估………………………….………. 63.最佳活性區分物之成分分離與功效評估…………………….………... 64. 探討最佳活性區分物抑制 agg Aβ1-40 細胞毒性之作用機制…………. 65. 材料與方法…………………………………………………………………….. 66、試驗材料…………………………………………………………………….. 66 (一) 科學中藥……………………………………………………………….. 66 (二) 原物料……………………………………………………….................. 66、實驗細胞株與動物………………………………………..…..…………… 66、試劑與試藥…………….…………………………………..….…………… 67 1. 標準品…………….…………………………………..…........................ 67 2. 細胞培養用之藥品與溶劑…………………………..…….………….. 67 3. 線蟲培養用之藥品與溶劑…………………………..….....………….... 69 4. 其他之藥品與溶劑…………………………………………………....... 70、裝置與儀器設備………………………………………………………….... 71、實驗方法……………………………………………………………………. 73驗 I ：抗阿茲海默症與延緩衰老功效食藥材之篩選…………..…....... 73一）試驗樣品之水與乙醇抽出物之製備……………………….…. 73二）Aβ1-40 聚集導致 PC-12 細胞氧化凋亡模式之建立……………. 73 1. PC-12 細胞培養……………………….………………...... 74. 細胞存活率測定………………………….……………....… 74. nPC-12 細胞生長曲線…………………………….….…..…. 75. Aβ1-40 糾結製備與毒性測試……………………..………..... 75. 試驗樣品水與乙醇抽出物抗 agg Aβ1-40 細胞毒殺作用之活性篩…………………………………………...….………75三）Sal B 之 HPLC 分析……………………………………..….…... 76四）EGb 761 之 HPLC 分析…………………………………………. 76五）線蟲模式之建立……………………………………………..… 77. 線蟲之單一寄生物培養（monoxenic culture）……..……. 77. 蟲卵分離…………………………..………………………… 78. 線蟲之無寄生物培養（axenic culture）與試驗樣品水與乙醇抽物延長線蟲壽命活性篩選………………………..…78六）統計分析…………………………………………………….…..…..….. 79驗 II：當歸、天麻與何首烏之甲醇萃取與溶劑區分物對分化後之 PC-12 (dPC-12)胞的保護作用……………………………………………….. 79一）當歸、天麻與何首烏甲醇粗抽出物與不同極性區分物之製備……..….. 79二）Aβ1-40 聚集導致分化的 PC-12 細胞氧化凋亡模式之建立………….…… 80. NGF 誘導 nPC-12 細胞分化………………………………………...... 80. Aβ1-40 聚集與毒性測試……………………………………………... 81三）試驗樣品不同極性區分物抗 agg Aβ1-4 細胞毒殺作用之活性篩選……. 81四）各試驗樣品具最佳活性之溶劑區分物的 HPLC 分析………………... 81. 當歸中 AS-M 與 AS-M-EA 之 HPLC 分析……………………….….. 81 . 何首烏中 PM-M 與 PM-M-EA 之 HPLC 分析…………………….. 82. 天麻中 GE-M 與 GE-M-B 之 HPLC 分析…………………………. 82五）統計分析……………………………………………………………….... 83驗 III：當歸、天麻與何首烏之甲醇萃取與溶劑區分物對線蟲壽命與抗氧化酵 素之影響……………………………………………………...….. 83一）野生型線蟲培養模式之建立與壽命期之計算…………………… 83. 線蟲取得與單一寄生物培養（monoxenic culture）…………. 83. 蟲卵之分離………………………………………………...… 83. 線蟲冷凍與無寄生物培養（axenic culture）………………….. 83. 試驗樣品不同極性區分物之線蟲培養與壽命期計算……….. 85. 試驗樣品不同極性區分物對線蟲體內 SOD 與 catalase 活性之影響. 88. 試驗樣品不同極性區分物對老齡線蟲壽命之影響…………………89二）統計分析……………………………………………………………….. 89驗 IV ：當歸乙酸乙酯層區分物之矽膠管柱層析與其 dPC-12 細胞的保護作 用………………………………………………………….……………………….. 89 一）當歸甲醇抽出物之乙酸乙酯層區分物的矽膠管柱層析…………………………89二）當歸矽膠管柱層析之各沖提區分物抗 agg Aβ1-40 細胞毒殺作用…….……..….. 90三）統計分析…………………………………………………………………….…..…90驗 V：最具抑制 agg Aβ1-40 毒性之當歸管柱沖提區分物對野生型與基因突變型線蟲amp;#63796;化之影響……………………………………………………….….….……... 91一）當歸管柱沖提區分物對野生型與基因突變型線蟲壽命之影響……….……..…91 1. 最具抑制 agg Aβ1-40 毒性之當歸矽膠管柱區分物的線蟲培養與壽命期計 算……………………………………………………………………...….………91二）當歸管柱沖提區分物對野生型與基因突變型線蟲體內氧化壓力之影響…….. 91. 最具抑制 agg Aβ1-40 毒性之當歸矽膠管柱區分物對線蟲體內 SOD與 catalase 活性之影響…………………………………………………....…... 91 . 最具抑制 agg Aβ1-40 毒性之當歸矽膠管柱提區分物對線蟲子代體內 SOD 與 catalase 活性之影響…………………………………………..……….…. 92 . 最具抑制 agg Aβ1-40 毒性之當歸矽膠管柱區分物對線蟲體內 ROS 含量之影…………………………………………………………………………..……... 92三）統計分析………………………………………………………………..……….. 93 驗 VI：AS-M-EA-F3、F-4 與 F9 三個管柱區分物保護 PC-12 細胞之可能機制…93 一） AS-M-EA-F3、F-4 與 F9 三個管柱區分物之抗氧化活性試驗……………... 93. 抑制銅離子誘導 LDL 氧化試驗…………………………………………….…93. DPPH 自由基之清除能力試驗……………………………………………….... 95二） 於細胞模式中探討 AS-M-EA-F3、F-4 與 F-9 保護 PC-12 細胞之可能機制.. 95. AS-M-EA-F3、F-4 與 F-9 抑制 agg Aβ1-40 細胞毒殺作用……………...…. 95 . AS-M-EA-F3、F-4 與 F-9 預處理對 dPC-12 細胞之保護作用………….….97 . AS-M-EA-F3、F-4 與 F-9 對細胞內鈣離子濃度之影響………………..……. 97. AS-M-EA-F3、F-4 與 F-9 對細胞內粒線體膜電位之影響…........................... 98三） 當歸有效活性區分物對 Aβ1-40 之聚集物的解集作用（disaggregation）……98. 以 Thioflavin T 分析 Aβ1-40 的聚集與解集作用……………………………. 98. 以原子力顯微鏡（Atomic force microscopy; AFM）掃描 Aβ1-40 聚集物的 構…………………………………………………………………………99四）統計分析……………………………………………………………………. 100 驗 VII、AS-M-EA-F3、F4 與 F9 三個管柱區分物對 daf-16 線蟲壽命之影響…101 一）daf-16 線蟲培養培養模式之建立與壽命期之計算……………………….. 101 二）AS-M-EA-F3、F4 與 F9 三個管柱區分物對 daf-16 線蟲壽命的影響…... 102三）統計分析……………………………………………………………………. 102 驗Ⅷ、AS-M-EA-F3、F4 與 F9 中活性成分之探討…………………………….. 102 一） 當歸生理活性物質之萃取與管柱層析………………………..….….….…. 102二） Aβ1-40 聚集與毒性測試………………………………………….….….…... 102三）當歸中的主要活性成分抗 agg Aβ1-40 細胞毒殺作用…………………….….. 103 (四) 當歸中的主要活性成分之 DPPH 自由基清除能力試驗………………….…103 五) 當歸中的主要活性成分對 agg Aβ1-40 的解集作用……………………..…. 103六) 統計分析……………………………………………………………….……. 103、結果與討論…………………………………………………………………….… 104驗 I ：抗阿茲海默症與延緩衰老功效食藥材之篩選…………………………… 104、結果………………………………………………………………………………. 104ㄧ） 以 nPC-12 細胞模式評估抗阿茲海默症活性……………………………... 104 1. nPC-12 細胞培養與 agg Aβ1-40 聚集（agg Aβ1-40）對 nPC-12 細胞之毒性試驗…………………………………………………………………………..…104. 篩選具有抗 agg Aβ1-40 細胞毒殺作用之試驗樣品水與乙醇抽出物…….… 105. Sal B 與 EGb 761 之 HPLC 分析…………………………..……………... 106 二）以線蟲為模式評估延緩衰老之活性……………………………………….….. 106. 線蟲之無寄生物培養（axenic culture）與試驗樣品水與乙醇抽出物對延長 蟲壽命活性之篩選…………………………………………………...……... 106、討論……………………………………………………………………………….. 107驗 II ：當歸、天麻與何首烏之甲醇萃取與溶劑區分物對分化後之 PC-12 細胞的護作用………………………………………………………………….... 116、結果………………………………………………………………………………... 116. NGF 誘導 nPC-12 細胞之分化情形………………………………………... 116. Aβ1-40 聚集對 dPC-12 細胞之毒性…………………………………..………. 116. 丹參酚酸 B（Salivianolic acid B, Sal B）與銀杏葉萃出物（EGb 761）對 agg Aβ1-40 導致 dPC-12 細胞死亡之抑制作用………………………………….. 117. 何首烏、當歸及天麻之甲醇粗抽出物與不同極性區分物對 agg Aβ1-40 導致PC-12 細胞死亡之抑制作用……………………………………….…….. 117. 當歸中具最佳活性之溶劑區分物的HPLC分析………………….….…….. 119 . 天麻中具最佳活性之溶劑區分物的 HPLC 分析………………………..… 120. 何首烏中具最佳活性之溶劑區分物的 HPLC 分析……………………..… 120、討論……………………………………………………………………………….. 121驗 III、當歸、天麻與何首烏之甲醇萃取與溶劑區分物對線蟲壽命與抗氧化酵素之響……………………………………………………………….…..……128、結果………………………………………………………………………….…….. 128 . UV 照射對 E. coli 生長之影響……………………………………..…..……. 128. 試驗樣品不同極性區分物之線蟲培養與壽命期計算………………...…… 128. 各試驗樣品之最佳活性區分物對野生型線蟲體內 SOD 與 catalase 活性之影響……………………………………………………………………………130 4. 各試驗樣品之不同極性區分物對老齡線蟲存活情形之影響………….. 131 、討論……………………………………………………………………………... 131驗Ⅳ：最佳活性區分物之成分分離與功效評估………………………………… 135. 最具活性區分物之矽膠管柱層析………………………………………….. 135. 各管柱區分對 agg Aβ1−40導致 dPC-12 細胞死亡之抑制作用…………… 135驗Ⅴ：最具抑制 agg Aβ1−40毒性之當歸管柱沖提區分物對野生型與基因突變型線 老化之影響……………………………………………………………136、結果…………………………………………………………………………….. 136 . 野生型線蟲與基因突變線蟲壽命延長模式之建立……………………… 136. 有效活性區分物對線蟲壽命期之影響…………………………………… 137. 當歸中有效活性區分物對線蟲體內 SOD 與 catalase 活性之影響……... 139. 當歸中有效活性區分物對線蟲子代體內 SOD 與 catalase 活性之影響... 140、討論…………………………………………………………………………….. 141驗 VI：AS-M-EA-F3、F-4 與 F9 三個管柱區分物保護 PC-12 細胞之可能機制............................................................................................................... 144一）AS-M-EA-F3、F-4 與 F9 三個管柱區分物之抗氧化活性試驗……… 144. 抑制銅離子誘導 LDL 氧化試驗…………………………………………… 144. DPPH 自由基之清除能力試驗………………………………………………….. 145 二）於細胞模式中探討 AS-M-EA-F3、F-4 與 F-9 保護 PC-12 細胞之可能機制….. 146 .AS-M-EA-F3、F-4 與 F-9 抑制 agg Aβ1-40細胞毒殺作用……………......... 146 . AS-M-EA-F3、F-4 與 F-9 預處理對 dPC-12 細胞之保護作用…….…………149. AS-M-EA-F3、F-4 與 F-9 對細胞內鈣離子濃度之影響…………………………150. AS-M-EA-F3、F-4 與 F-9 對細胞內粒線體膜電位之影響………………….. 154三)當歸有效活性區分物對 Aβ1-40 之聚集物的解集作用（disaggregation）………156. 以 Thioflavin T 分析 Aβ1-40 的聚集與解集作用………………………….. 156. 以原子力顯微鏡（Atomic force microscopy; AFM）掃描 Aβ1-40 聚集物的結構…………………………………………………………………………….. 158. 驗 VII、AS-M-EA-F3、F4 與 F9 三個管柱區分物對 daf-16 線蟲壽命之影響…... 163 驗Ⅷ、AS-M-EA-F3、F4 與 F9 中活性成分之探討………………………………. 165. 當歸生理活性物質之萃取與管柱層析……………………………………….. 165. Aβ1-40 之聚集與毒性試驗………………………………………………………... 165. 當歸生理活性物質之篩選………………………………………………………. 166. 當歸中主要活性成分之抗氧化能力……………………………………………. 167. 當歸中主要活性成分對 agg Aβ1-40 之解集作用……………………………... 167 amp;#63955;、結論………………………………………………………………………170、參考文獻…………………………………………………………279次5-I-1. nPC-12細胞生長曲線……………..………………………………….…...1725-I-2. Agg Aβ1-40處理時間對nPC-12細胞的細胞毒性………………...……....1735-I-3.不同濃度agg Aβ1-40對nPC-12細胞的細胞毒性…………………….......1745-I-4. Sal B 對agg Aβ1-40細胞毒性與nPC-12細胞的影響….............................1755-I-5. EGb 761 對agg Aβ1-40細胞毒性與nPC-12細胞的影響………..….…....1765-I-6. Sal B 之HPLC分析圖譜….........................................................................1795-I-7.銀杏樣品於三種不同管柱中的HPLC層析圖（文獻） …...........................1805-I-8. EGb 761 之HPLC分析圖譜..…………………….……………….….......181 5- I-9.各樣品水抽出液對C. elegans壽命期之影響…………………………....1835-I-10.各樣品乙醇抽出液對C. elelgans壽命期之影響…..………………….....1845-II-1. PC 12 細胞分化過程.……..………………………………….………......186 5-II-2.血清與NGF對PC 12細胞生長之影響……………….……………...…....187 5-II-3. PC 12細胞分化過程中MTT assay 數值變化…….….............................1885-II-4. agg Aβ1-40對不同分化天數dPC-12細胞的細胞毒性……………..….....189 5-II-5. agg Aβ1-40對dPC-12細胞的細胞毒性……………….…….……...….....190 5-II-6. Sal B 對agg Aβ1-40細胞毒性與dPC-12細胞的影響………….……….191 5-II-7. EGb 761 對agg Aβ1-40細胞毒性的影響.....................................................1925-II-8. AS-M-EA之HPLC分析圖（與文獻比對）……………………………........1975-II-9. GE-M與GE-M-B之HPLC分析圖譜（與文獻比對）…………………........1985-II-10. PM-M之HPLC分析圖譜（與文獻比對）…………………………............199圖5-II-11. PM-M、PM-M-EA與相關標準品之HPLC分析圖譜………………..........2005-III-1. UV 照射時間與E. coli存活菌數….…………………………….…..........2015-III-2. EUK-8與當歸不同極性區分物對野生型C. elegans壽命之影響……....2025-III-3.EUK-8與何首烏不同極性區分物對野生型C. elegans壽命之影響….....2035-III-4. EUK-8與天麻不同極性區分物對野生型C. elegans壽命之影響….…....2045-IV-1.當歸生理活性物質之萃取與管柱層析流程圖………………………..…..2095-V-1. EUK-8對野生型與突變種線蟲生存情形之影響…………………..….....213 圖5-V-2. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對野生型C. elegans壽命之影響..….215 5-V-3. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對突變種mev-1壽命之影響…….….217 5-V-4. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對突變種daf-2壽命之影響………....2195-V-5. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物延長野生型與突變種線蟲壽命之影響…………………………….……………..…………………………………………2215-Ⅵ-1. Trolox與當歸中三個有效之矽膠管柱區分物對LDL oxidation之影響………………………………………………………………..…………………..…2295-Ⅵ-2. Trolox與當歸中有效區分物對DPPH自由基之清除能力………………2315-VI-3. Agg Aβ1-40 對dPC-12細胞內ROS生成量之影響……………………..2355-Ⅵ-4. Sal B、EGb 761與當歸活性區分物預培養對agg Aβ1-40作用24 小時導致 dPC-12細胞損傷之影響……………………………………………………………..2375-Ⅵ-5. agg Aβ1-40處理時間與dPC-12細胞存活率之變化…………….……….2385-Ⅵ-6. Sal B、EGb 761與當歸活性區分物預培養對agg Aβ1-40作用6 小時導致dPC-12細胞損傷之影響…………………………………………………….……….2395-Ⅵ-7. Sal B、EGb 761與當歸活性區分物預培養對dPC-12細胞之影響……………………………………………………………………………...……….2405-Ⅵ-8. Agg Aβ1-40 (30 μM)對dPC-12細胞內鈣離子濃度之影響……………...2415-Ⅵ-9. Agg Aβ1-40 (40 μM)對dPC-12細胞內鈣離子濃度之影響………..……..2425-Ⅵ-10. Agg Aβ1-40 (40 μM)對dPC-12細胞內鈣離子濃度之影響……..………2435-Ⅵ-11. Sal B、EGb 761與當歸中三個有效之矽膠管柱區分物對agg Aβ1-40造成dPC-12細胞內鈣離子濃度增加之影響…………………………………..…………..2445-Ⅵ-12. Sal B、EGb 761與當歸中三個有效之矽膠管柱區分物對agg Aβ1-40造成dPC-12細胞內鈣離子濃度增加之保護作用……………………………………….…2455-Ⅵ-13. Sal B、EGb 761、當歸中三個有效之矽膠管柱區分物與agg Aβ1-40共同培養24 小時對dPC-12細胞內鈣離子濃度增加之影響………….…………………2465-Ⅵ-14. 不同濃度agg Aβ1-40 對dPC-12細胞粒線體膜電位之影響…………….2475-Ⅵ-15. Sal B、EGb 761與AS-M-EA對agg Aβ1-40 改變dPC-12細胞粒線體膜電位之影響 ………………………………………………….……………………….….2485-Ⅵ-16. AS-M-EA-F3, F-4與F-9對agg Aβ1-40 改變dPC-12細胞粒線體膜電位之影響………………………………………………………………………..……….…..2495-Ⅵ-17. Sal B、EGb 761、AS-M-EA與F3、F4、F9對agg Aβ1-40 改變dPC-12細胞粒線體膜電位之影響 ……………………………………………….…...…….…..2505-Ⅵ-18. 不同濃度agg Aβ1-40與Thioflavin T之螢光強度………………….…….2515-Ⅵ-19. Sal B、EGb 761與當歸活性區分物對agg Aβ1-40之影響……………….2525-VI-20. 不經HFIP處理之 Aβ1-40聚集後之AFM 掃描圖……………..………..2535-VI-21. Aβ1-40 protofibrils之AFM 掃描圖………………………….…………….254 5-VI-22. Aβ1-40 （HFIP-treated）聚集與纖維化過程之AFM 掃描圖（12-24 hr）..255 5-VI-23. Aβ1-40（HFIP-treated）聚集與纖維化過程之AFM 掃描圖（48 hr）…2565-VI-24. 纖維狀Aβ1-40（HFIP-treated）之AFM 掃描圖…………………….….2575-VI-25. Aβ1-40（HFIP-treated）聚集時間與其對PC-12細胞之細胞毒性….….2585-VI-26. Sal B 促進Aβ1-40纖維之解集作用……………………………….……..2595-VI-27. EGb 761 促進Aβ1-40纖維之解集作用………………………………..…2605-VI-28. AS-M-EA-F3 對Aβ1-40纖維結構之影響……………………….……….2615-VI-29. AS-M-EA-F4 對Aβ1-40纖維結構之影響……………………………….2625-VI-30. AS-M-EA-F9 對Aβ1-40纖維結構之影響…………………..……………2635-VI-31. AS-M-EA-F9 對Aβ1-40纖維結構之影響………………………………..2645-VII-1. EUK-8對daf-16線蟲生存情形之影響………………………...…….….2655-VII-2. AS-M-EA-F3對daf-16線蟲生存情形之影響……………..…….………2665-VII-3. AS-M-EA-F4對daf-16線蟲生存情形之影響……………..……..…….2675-VII-4. AS-M-EA-F9對daf-16線蟲生存情形之影響………………….….……2685-Ⅷ-1.當歸生理活性物質之萃取與管柱層析流程圖……………………...…..270 5-Ⅷ-2. Aβ1-40的聚集時間與其對dPC-12細胞之細胞毒性……………………272 5-Ⅷ-3.由ASMEA 中分離出四個活性物質之化學結構…………………...…2745-Ⅷ-4. Trolox與當歸中主要活性區分物對DPPH自由基之清除能力…….…2765-Ⅷ-5. Sal B、EGb 761與當歸活性區分物對agg Aβ1-40之解集作用……….278圖1. Ferulic acid、coniferyl ferulate與AS-M-EA之HPLC分析圖………..…324圖2. 當歸中的主要化學物質…………………………………………………….325圖3. 天麻中的主要化學物質…………………………………………………….327圖4. GE-M與GE-M-B與其主要化學物質的HPLC層析圖……………….…328圖5. 何首烏中的主要化學物質…………………………………………………329圖6. 不同營養條件對線蟲體型與生活史等特徵的影響……………………….330圖7. 突觸的訊息傳遞與神經退化性疾病的關係…………………………….…331圖8. Cdk5所調節的神經元死亡…………………………………………………332圖9. Aβ聚集與fibril formation的過程………………………………………….333圖10. Aβ的3D結構圖與胺基酸序列…………………………………………..334圖11. Parallel β helix 的3D結構圖……………………………………………..335圖12. Aβ1-40 protofibrils 之AFM掃描圖……………………………………….336圖13. 以電子顯微鏡分析Sal B對Aβ1–40聚集作用的影響………………….337圖14. AS-M-EA、F4與F9之HPLC分析圖譜…………………………………343次5-I-1.各試驗樣品水抽出物抑制agg Aβ 1-40細胞毒性之能力與對C-12細胞生長之影響…………………..……………………………….…………..1775-I-2.各試驗樣品乙醇抽出物抑制agg Aβ 1-40細胞毒性之能力與對PC-12細胞生長之影響…………………..………………………….………………………….........1785-I-3.各樣品抽出物對E. coli OP50生長影響……………….….……………...1825-I-4.各樣品抽出液對C. elegans壽命之影響…………………..….………....185 表5-II-1.當歸、天麻與何首烏甲醇萃取與三種溶劑區分之萃出率………..…....193表5-II-2.當歸甲醇粗抽出物與其不同極性區分物對抑制agg Aβ1-40 細胞毒性與dPC-12細胞生長之影響……………………………..1945-II-3.天麻甲醇粗抽出物與其不同極性區分物對抑制agg Aβ 1-40 細胞毒性與dPC-12細胞生長之影響……………………………..………………….…..…….....1955-II-4.何首烏甲醇粗抽出物與其不同極性區分物對抑制agg Aβ 1-40 細胞毒性與dPC-12細胞生長之影響…………………………………………………………......1965-III-1. EUK-8與各樣品之不同極性區分物對野生型C. elegans壽命之影響…………………………………………..........205 5-III-2. EUK-8與各樣品之不同極性區分物對野生型C. elegans體內SOD性之影響…………………………………………………………….2065-III-3. EUK-8與各樣品之不同極性區分物對野生型C. elegans體內catalase活性之影響……………………………………........2075-III-4. EUK-8與各樣品之不同極性區分物對老齡線蟲存活情形之影響……………………………………………………………………….…………......2085-Ⅳ-1.當歸乙酸乙酯層區分物經矽膠管柱層析所得之各沖提區分.................................................210 5-IV-2.當歸乙酸乙酯層區分物經矽膠管柱層析後各沖提區分對agg Aβ1-40傷害dPC-12細胞之影響與對dPC-12細胞之毒性……………………………………….2115-V-1. EUK-8對野生型C. elegans與突變種壽命之影響……………………..2145-V-2. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對野生型C. elegans壽命之影響…..216 5-V-3. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對突變種mev-1壽命之影響………..2185-V-4. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對突變種daf-2壽命之影響………….2205-V-5. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對野生型C. elegans體內SOD活性之影響…………………..……………………………………2225-V-6. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對mev-1體內SOD活性之影響…...2235-V-7. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對daf-2體內SOD活性之影………..2245-V-8.EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對C. elegans體內catalase活性之影響…………………………………………………………………....2255-V-9.EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對mev-1體內catalase活性之影響………………………………………………………....2265-V-10. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對daf-2體內catalase活性之影響……………………………………………………………………………..………..2275-V-11. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對線蟲子代體內SOD 與catalase活性之影響…………………………………………………………………………………….2285-Ⅵ-1.以銅離子誘導LDL氧化分析當歸中三個有效之矽膠管柱區分物抗氧化之活性…………………………………………………………………………….....…..2305-Ⅵ-2. Trolox與當歸中有效區分物之DPPH清除能力………………………2325-Ⅵ-3.當歸中三個有效之矽膠管柱區分物對agg Aβ1-40傷害dPC-12細胞之影響與對dPC-12細胞之毒性 ( MTT assay )……………………………………………..2335-Ⅵ-4.當歸中三個有效之矽膠管柱區分物對agg Aβ1-40傷害dPC-12細胞之影響與對dPC-12細胞之毒性（WST-1 assay）…………………………………………..2345-Ⅵ-5.當歸中三個有效之矽膠管柱區分物對agg Aβ1-40導致PC-12細胞內ROS生成之影響…………………………………………………………………….………2365-VII-1. EUK-8與當歸之矽膠管柱區分物對daf-16線蟲壽命之影響………....2695-Ⅷ-1.當歸乙酸乙酯層區分物經矽膠管柱層析所得之各沖提區分…………..2715-Ⅷ-2.當歸中三個有效之矽膠管柱區分物對agg Aβ1-40傷害dPC-12細胞之影響與對dPC-12細胞之毒性 ( MTT assay )……………………………………………..2735-Ⅷ-3.當歸中的主要活性成分對agg Aβ1-40傷害dPC-12細胞之影響與對dPC-12細胞之毒性 ( MTT assay )………………………………………………………...…..2755-Ⅷ-4. Trolox與當歸中有效區分物之DPPH清除能力…………………………277表1. Polyphenols 抑制類澱粉性蛋白(amyloidogenic protein)聚集的IC50…..…..339表2. 具有抑制Aβ聚集的多酚類結構…………………………...………………340表3. daf-2(-)後所提升的基因…………………………………….….……………342表4. 四種純化物於AS-M-EA及F4與F9中所佔比例 (w/w)……………………..344application/pdf13308916 bytesapplication/pdfen-US老化阿茲海默症線蟲PC-12細胞當歸AgingAlzheimer’s diseaseC. elegansPC-12 cellsAngelica sinensis[SDGs]SDG3thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/182188/1/ntu-98-F88641026-1.pdf