黃立民王錦堂臺灣大學：謝育嘉Hsieh, Yu-ChiaYu-ChiaHsieh2007-11-272018-07-062007-11-272018-07-062006http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/55524肺炎雙球菌是造成兒童細菌性肺炎最常見的病因。就我們所知，不論肺炎雙球菌肺炎在疾病過程中多嚴重，最後都能恢復肺部結構，少見壞死性肺炎。而自從盤尼西林的發現後，肺炎雙球菌肺炎也很少進行到膿胸。不過，自1990年代開始，兒童肺炎雙球菌肺炎有併發症的比率，如壞死性肺炎、肺膿瘍、膿胸被注意到有逐漸增加的情形。造成兒童肺炎雙球菌肺炎併發症增加的真正原因仍不清楚。 在台灣是抗藥性肺炎雙球菌的高盛行區。最近幾年，我們也常注意到兒童肺炎雙球菌肺炎容易併發壞死或化膿。由我們收集在臺大醫院八年 (1995-2003) 之間造成肺炎雙球菌肺炎的菌株中發現，菌株的抗藥性與血清型在大葉性肺炎與複雜性肺炎兩組病人之間的分佈無明顯差異。但我們注意到有一主要脈衝場膠電泳法分型的菌株散播在兒童肺炎雙球菌肺炎之間。這一主要脈衝場膠電泳法分型的菌株是一地區性、具多重抗藥性、血清型為14的肺炎雙球菌。它在大葉性肺炎菌株中佔的比例是20% (4/20)；在複雜性肺炎菌株中佔的比例是50% (10/20)；這一血清型為14的主要脈衝場膠電泳法分型的菌株與複雜性肺炎雙球菌肺炎有統計上明顯的相關(p=0.047 by chi-square test)。 為了了解造成複雜性肺炎肺炎雙球菌的致病因子與病理機制，我們利用幼鼠的動物模式來觀察這一血清型14的主要脈衝場膠電泳分型的菌株的致病力。並利用微陣列分析造成複雜性肺炎的肺炎雙球菌(NTUH-p28與NTUH-p15，ST46)與沒有造成複雜性肺炎的肺炎雙球菌(NTUH-p3，ST328)的基因表現差異。 首先，我們在幼鼠身上成功的以這一株血清型14的主要菌株製造出複雜性肺炎雙球菌肺炎(NTUH-p28與NTUH-p15)，包括壞死性肺炎與肺膿瘍。肺部的壞死與膿瘍的產生與細菌量及細胞激素的產生有關。利用微陣列，我們發現zmpB基因的訊號有所差異；更進一步分析顯示是由於NTUH-p28與NTUH-p3 zmpB基因序列差異而造成的訊號差異。在感染zmpB剔除突變株(ΔzmpB of NTUH-p15)的幼鼠發現，肺部的細菌量、細胞激素明顯下降，也沒有肺部組織被破壞的情形。而將幼鼠感染zmpB異位互補株(zmpB complentation stain of NTUH-p15)後，肺部的細菌量、細胞激素明顯較zmpB剔除破壞性突變株(ΔzmpB of NTUH-p15)感染時上升；肺部組織也有壞死的現象。有趣的是將NTUH-p3的zmpB剔除突變株補回NTUH-p15的zmpB基因後，互補株感染後所引起的肺部細菌量顯著高於NTUH-p3野生株。 由以上結果可結論，zmpB基因序列的差異會影響肺炎雙球菌的致病力。而NTUH-p15的zmpB基因是肺炎雙球菌造成複雜性肺炎的重要致病因子。誌謝………………………………………………………………....2 目錄………………………………………………………….….…..3 一、 中文摘要……………………………………………… …5 二、 緒論………………………………………… ……..…..7 三、 材料及研究方法 3.1 病人……………………………………………….….22 3.2 材料： 3.2.1 肺炎雙球菌………….……………………………..... .22 3.2.2 大腸桿菌…………………………………………….…...23 3.2.3 質體……………………………………….………….....23 3.2.4 培養基…………………………………………………..24 3.2.5 抗生素…………………………………………………..24 3.2.6 引子……………………………………………………..24 3.3 研究方法： 3.3.1 Multilocus sequencing typing (MLST)……………… 25 3.3.2 脈衝電泳………………………………………………..25 3.3.3 肺炎雙球菌基因體DNA的抽取………… ………………26 3.3.4 肺炎雙球菌基因體RNA的抽取………………… ………26 3.3.5 肺炎雙球菌基因微陣列的介紹………………………..26 3.3.6 基因微陣列探針的合成………………………………..26 3.3.7 基因微陣列探針的的雜交及影像分析…………………28 3.3.8 基因剔除菌株的建構………………………………… .29 3.3.9 異位補回zmpB基因…………………… …………… ..30 3.3.10 real-time PCR…………………………………………30 3.3.11 動物實驗……………………………………………….32 3.3.12 統計…………………………………………………….33 四、 結果 臨床部分……………………………………………………………34 基礎部分 4.1 這一特別的菌株顯著與兒童肺炎雙球菌肺炎有關… 35 4.2 幼鼠肺炎雙球菌壞死性肺炎與高菌量，高多核性白血性浸潤及強烈發炎細胞激性的釋放有關…………………………….35 4.3 在成鼠肺炎雙球菌肺炎的模式中，NTUH-P28與NTUH-P3的致病力差異並沒有顯示出來…………………………………….36 4.4 微陣列分析……………………………………………36 4.5 肺部組織的破壞與感染劑量有關並探討NTUH-p15菌株zmpB基因的角色……………………………………………………….36 4.6 zmpB基因序列的差異會影響肺炎雙球菌的致病力…37 五、 討論………………………………………………….39 六、 展望………………………………………………….46 七、 英文簡述…………………………………………….48 八、 參考文獻…………………………………………….61 九、 圖表………………………………………………….68 十、 在修業期間發表之相關文獻……………………….863408972 bytesapplication/pdfen-US壞死性肺炎肺膿瘍微陣列肺炎雙球菌necrotizing pneumonialung abscessmicroarrayStreptococcus pneumoniaetexthttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/55524/1/ntu-95-D90421007-1.pdf