陳義雄Chen, Yee-Hsiung臺灣大學:生化科學研究所曾煥清Tseng, Huan-ChinHuan-ChinTseng2010-05-042018-07-062010-05-042018-07-062009U0001-3007200916012700http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/178906小鼠貯精囊分泌液以還原性 SDS-PAGE 電泳分析，可以觀察到七個明顯的蛋白，按照分子量大小命名為 SVS I-VII。而實際上在貯精囊液中幾乎沒有 SVS I、SVS II、和SVS III以單體形式存在，它們會以雙硫鍵連結成分子量非常大的不同蛋白質複合體 (high molecular weight complexes, HMWCs)。經由免疫組織染色法證明 SVS I、SVS II、SVS III蛋白是組成交配栓的蛋白成分。將交配栓以還原性SDS-PAGE sample buffer 粹取，幾乎沒有 SVS I 和 SVS II 被溶解出來，只有少量 SVS III 會被溶解出來，顯示在交配栓中 SVS I-III 之間除了雙硫鍵之外還有其他共價鍵參與其中。進一步純化凝固腺中轉麩胺醯酶 （TG4），並且與組織內的轉麩胺醯酶 (TG2) ，比較催化貯精囊分泌蛋白的酵素活性。我們發現 TG4 對於 HMWCs 具有較高的活性。然而 TG2 對於還原後貯精囊液中自由的 SVS I-III 蛋白具有較佳的活性。這種高效率的 TG4 催化在，精液凝固而形成交配栓是一重要的生化反應，其生殖的意義會加以討論。VS I 蛋白質序列共有 820 個胺基酸，其中 43 個為麩胺酸 43 個為離胺酸。，我們根據其序列製備 7 段重組蛋白，分成 1-78 胺基酸序列為 F1 片段、79-259 胺基酸序列為 F2 片段、260-405 胺基酸序列為 F3 片段、406-500 胺基酸序列為 F4 片段、501-650 胺基酸序列為 F5 片段、651-715 胺基酸序列為 F6 片段以及 716-796 胺基酸序列為 F7 片段。比較 F1~F7 片段被 TG4 催化後所接上 BPNH2 或 A25 peptide的數量。F2 片段對於 BPNH2 作用的活性遠大於其他片段，而 A25 peptide 對於各片段的反應活性相對較低。質譜分析經 TG4 催化，而連結上 BPNH2 的 F2 片段，鑑定出 Q232 和 Q254 是TG4 作用標的。將 F2 片段的 Q232 和 Q254 突變為三種 F2 片段 (Q232G、Q254G 和Q232G/Q254G)，BPNH2 連接上去的數量相對原始 F2 片段減少，確認 Q232 和 Q254 為 TG4 催化的主要目標。Resolution of mouse seminal vesicle secretion (SVS) by reducing SDS-PAGE can clearly identified seven major monomer proteins tentatively designated as SVS I-VII according to the decreasing order of their molecular masses. However, no monomer forms of SVS I-III are present in SVS. Instead, they appear in various high molecular weight complexes (HMWCs) formed by inter-polypeptide disulfide bridges among SVS I, SVS II and SVS III. The HMWCs become the predominant protein in SVS. We were able to immunodetect SVS I-III in cross sections of mouse copulatory plug. Heating the clotted lump in SDS-PAGE sample buffer in the presence of DTT released none of SVS I or SVS II but only a trace of SVS III into the solution, indicative of covalent cross-links in addition to disulfide bonds among the SVS I-III proteins in the plug. Further, we purified type 4 transglutaminase (TG4) from the mouse coagulating gland to homogeneity, and compared it to type 2 transglutaminase (TG2) from guinea pig liver in terms of enzymatic ability to cross-link proteins in the SVS. We found that TG4 showed much greater activity than TG2 in catalyzing the cross-links between HMWC proteins. On the contrary, it was less active than TG2 in cross-linking any of the free SVS I-III proteins released from the reduced HMWC. The reproductive significance of more efficient TG4 catalysis is discussed.ased on the SVSI-deduced protein sequence, SVS I contains 820 amino acid residues in which there are 43 glutamine and 43 lysine residues. We produced 7 recombinant polypeptide fragments including residues 1-78/F1, residues 79-259/F2, residues 260-405/F3, residues 406-500/F4, residues 501-650/F5, residues 651-715/F6, and residues 716-796/F7, and measured the covalent incorporation of 5-(biotinamido)pentylamine (BPNH2) or biotin-TVQQEL (A25 peptide) to each of F1-to-F7 by TG4. F2 was much more active than the other fragments during the BPNH2-glutamine incorporation, Relatively, a low extent of A25 cross-linking to any one of the seven polypeptide fragments was observed. The MS analysis of BPNH2-F2 conjugate identified Q232 and Q254 as the two major TG4 cross-linking sites. This was substantiated by the result that much less BPNH2 was cross-linked to any one of three F2 mutants, including Q232G and Q254G obtained from single-site mutation, and Q232G/Q254G from double-site mutation.縮寫表 III要 IV bstract V 一章 緒論 1.1 生殖學概論 1.2 哺乳類雄性生殖系統 1.3 附屬性腺的研究 2.3.1 附屬性腺的差異 2.3.2 附屬性腺的生理功能 3.3.3 附屬性腺的病理研究 4.4 前列腺的發育與功能 4.5 貯精囊發育與功能 4.6 交配栓 6.6.1 交配栓的形成 6.6.2 交配栓的功能 6.7 轉麩胺醯胺酶的功能 7.7.1 轉麩胺醯胺酶的分類 7.7.2 轉麩胺醯胺酶催化的轉化醯基反應 8.7.3 轉麩胺醯胺酶的活性反應區和結構 8.7.4轉麩胺醯胺酶的基質選擇性 9.8 研究背景 10.8.1小白鼠貯精囊 SVS I 之研究 10.8.2交配栓內貯精囊液蛋白的共價鍵結 11二章 材料與方法 12.1實驗材料 12.1.1 化學試劑與酵素 12.1.2 實驗動物 12.2 SVS I-III 抗體製備 12.2.1 重組質體的製備 12.2.2 重組蛋白的純化 13.3 免疫組織染色 13.4 對角線電泳分析 14.5 小鼠 TG4 純化 14.6 Solid-Phase Microtiter Assay 15.7 蛋白質交聯實驗 15.8 SVS I F1-F7 片段的製備 15.8.1 重組質體的製備 15.8.2 重組蛋白的純化 16.9 製備接上 BPNH2 的 SVS I F2 片段 17三章 實驗結果 18.1交配栓內貯精囊液蛋白的共價鍵結 18.1.1小鼠 SVS I、SVS II、SVS III 抗體製備 18.1.2 SVS I-III是交配栓的組成成分8.1.3 貯精囊分泌蛋白 SVS I-III 會形成高分子聚合物 18.1.4交配栓內 SVS I-III 之間共價鍵結 19.1.5 生殖系統特有的轉麩胺醯酶 19.1.6 純化及鑑定小鼠凝固腺分泌蛋白TG4 20.1.7 TG4酵素活性測定 20.1.8 在貯精囊分泌蛋白中SVS I-III是TG4的基質 21.1.9 HMWCs 分子間雙硫鍵對於TG作用的影響 21.2 鑑定貯精囊蛋白SVS I被凝固腺液之轉麩胺醯酶催化的活性部位 22.2.1 製備SVS I F1~F7片段重組蛋白 22.2.2 鑑定 SVS I 被催化的活性部位 22四章 討論 58.1 SVS I-III 參與交配栓的形成 58.2 TG4 催化 HMWCs 內的蛋白鍵結 58.3 小鼠 SVS I 與 TG 的作用 59eferences 60application/pdf1901718 bytesapplication/pdfen-US貯精囊凝固腺轉麩胺醯酶蛋白質交聯精液凝結交配栓seminal vesiclecoagulating glandtransglutaminaseprotein cross linkseminal coagulationcopulatory plughttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/178906/1/ntu-98-D92b46012-1.pdf