賴明宗臺灣大學:免疫學研究所莊雅婷Chuang, Ya-TingYa-TingChuang2010-05-102018-07-092010-05-102018-07-092008U0001-0406200822103800http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/181779DAPK 是一個具有多個功能區域的絲/酥胺酸(serine/threonine)蛋白質激脢，具有抑癌功能，同時也會參與各式的細胞凋亡系統。DAPK 的分子作用機制目前仍不太清楚，其在T 細胞中所扮演的角色也從未被探討過。我們發現DAPK 在T 細胞活化時亦會被活化，然後DAPK 會被分解。我們在T 細胞株和正常的小鼠T 細胞轉殖基因表現活化的DAPK 和會抑制DAPK 活性的變異體，或是利用siRNA 降低DAPK 的表現，發現DAPK 會負向調控T 細胞的活化。DAPK 會影響T 細胞活化後之增殖反應以及IL-2 的產生。同時也發現DAPK 的作用目標之ㄧ是TCR 刺激後引發的NF-κB 活化。在DAPK 被抑制或調降的T 細胞中，PKCθ磷酸化會增加，而進入核中之NF-κBp65 也提升。相對的，IL-1β和TNF-α刺激所引發的NF-κB活化並不受DAPK 影響。我們更進一步發現在T 細胞活化時，DAPK 只會選擇性地影響PKCθ、Bcl-10 和 IKK 等與NF-κB 活化相關的訊息分子進入脂質筏，但對於其他位於脂質筏的分子，例如LAT 和Lck，則沒有影響。們接著探討DAPK 是否藉著抑制T 細胞活化而參與T 細胞耐受性之產生。以A23187 增加鈣離子濃度在體外誘導T 細胞去活化，或以靜脈注射CD3 抗體到小鼠體內直接誘導T 細胞去活化的方式，都可以發現在去活化的T 細胞，DAPKmRNA 的表現增加。DAPK 的表現量與T 細胞去活化的程度成正比，顯示DAPK可能在T 細胞耐受度上扮演角色。此外，我們也發現表現活化的DAPK 會抑制小鼠誘發產生實驗性自身免疫性腦脊髓炎。我們的結果顯示了DAPK 是個新的T 細胞調控分子，會主導T 細胞活化以及TCR 刺激引發的NF-κB 活化。同時，DAPK亦可調節T 細胞去活化而維持活體免疫耐受度以避免自體免疫之產生。Death-associated protein kinase (DAP-kinase, DAPK) is a unique multi-domain kinase acting both as a tumor suppressor and an apoptosis inducer. The molecular mechanism underlying the effector function of DAPK is not fully understood, while the role of DAPK in T lymphocyte activation is mostly unknown. DAPK was activated after TCR stimulation, followed by DAPK degradation. Through the expression of a dominant negative form and a constitutively active form of DAPK in T cell lines and in transgenic mice, we found that DAPK negatively regulated T cell activation. DAPK markedly affected T cell proliferation and IL-2 production. We identified TCR-induced NF-κB activation as a target of DAPK. There was an increased PKCθ phosphorylation and an enhanced NF-κBp65 nuclear translocation in T cells with DAPK inhibited or down-regulated. In contrast, IL-1β- and TNF-α-triggered NF-κB activation was not affected by DAPK. We further found that DAPK selectively modulated the TCR-induced translocation of PKCθ, Bcl-10, and IKK into membrane rafts. Notably, the effect of DAPK on the raft entry was specific for NF-κB pathway, as other raft-associated molecules, such as LAT, were not affected. We further examined the possibility that, by negatively regulating T cell activation, DAPK contributes to the generation of T cell tolerance. DAPK mRNA expression was up-regulated when T cell anergy was induced either in vitro by calcium ionophore, or in vivo by intravenous administration of anti-CD3 antibody. There was a correlation between the amount of DAPK expression and the extent of T cell anergy, suggesting a role of DAPK in T cell tolerance induction. In addition, active DAPK transgene inhibited the induction and progression of autoimmune experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Our results demonstrate that DAPK is a novel T cell regulator on TCR-activated NF-κB and T cell activation, and DAPK may contribute to maintenance of immune tolerance and avoidance of autoimmunity by promoting T cell anergy.口試委員會審定書……………………………………………………… i謝……………………………………………………………………… ii文摘要………………………………………………………………… iii文摘要………………………………………………………………… iv一章 緒論………………………………………………………..……. 1、 DAPK…………………………………………………………… 1. DAPK 之簡介…………………………………………………… 1. DAPK 之蛋白質結構…………………………………………….. 1. DAPK 的抑癌功能與促細胞凋亡活性…………………………... 3、 T 細胞活化……………………………………………………... 4. T 細胞活化的訊息傳遞…………………………………………... 4. PKCθ…………………………………………………………………6. 脂質筏與T 細胞活化的關係……………………………………. 7、 NF-κB 活化之訊息傳遞路徑………………………………….. 9、 T 細胞去活化…………………………………………………. 10、 研究動機與方向………………………………………………. 11二章 材料與方法…………………………………………………… 12、 細胞株與細胞培養……………………………………………. 12、 藥品與試劑……………………………………………………. 12、 抗體……………………………………………………………. 13、 質體之構築………………………………………………………13. pGC-YFP-DAPK、pGC-YFP-K42A 和pGC-YFP-ΔCAM 之構築…13. pSR-mDAPKsi 和pSR-mDAPKsim 之構築………………………14. pSR-hDAPKsi-1、pSR-hDAPKsi-2 和pSR-hDAPKsim 之構築… 14. CD2-K42A 和CD2-ΔCAM 之構築………………………………… 14、 質體DNA 的轉染……………………………………………… 15. Calcium phosphate 轉染法……………………………………… 15. 反轉錄病毒感染法…………………………………………………15. 電穿孔法……………………………………………………………16、 IL-2 產量分析………………………………………………… 16、 T 細胞增殖分析……………………………………………….. 17、 RNA 的純化…………………………………………………….. 17、 反轉錄與聚合酶連鎖反應…………………………………….. 17、 流式細胞儀分析……………………………………………….. 18. 細胞死亡測定…………………………………………………….. 18. 細胞表面染色分析……………………………………………….. 19一、 細胞萃取液的製備………………………………………….. 19. 全部細胞萃取液的製備………………………………………….. 19. 細胞質及細胞核萃取液的製備………………………………….. 19二、 西方墨點法………………………………………………….. 20三、 免疫沉澱法………………………………………………….. 20四、 電泳移動改變分析法……………………………………….. 20. 探子的製備……………………………………………………….. 21. 電泳移動改變分析……………………………………………….. 21五、 脂質筏的分離與純化……………………………………….. 21六、 X 光底片影像訊號強弱測量……………………………….. 22七、 T 細胞去活化的誘導……………………………………….. 22. 誘導AND 轉殖基因小鼠T 細胞的去活化……………………… 22. 抗小鼠CD3 抗體的靜脈注射誘導T 細胞去活化……………… 22八、 實驗性自身免疫性腦脊髓動物模式…………………………23三章 結果…………………………………………………………… 24、 T 細胞活化時DAPK 亦被活化而後分解……………………... 24、 DAPK 之持續活化變異體抑制T 細胞活化，而顯負性變異體則會增強T 細胞活化……………………………………………... 25、 利用siRNA 降低DAPK 的表現可增強T 細胞活化………..... 26、 [K42A]DAPK 和[ΔCAM]DAPK 兩種轉殖基因鼠的生產與表現………………………………………………………………... 27、 [K42A]DAPK 轉殖基因會增強T 細胞活化，而[ΔCAM]DAPK轉殖基因則會抑制T 細胞活化……………………………….. 28、 DAPK 抑制TCR 刺激所引發的NF-κB 活化……………….... 30、 DAPK 不影響TNF-α和IL-1β刺激所引發的NF-κB 活化…... 32、 抑制DAPK 活性可增加PKCθ、Bcl-10 和IKKα等訊息分子轉移進入脂質筏中的量……………………………………………... 32、 DAPK 在去活化T 細胞的表現增加…………………………... 33. 體外誘發AND 轉殖基因小鼠T 細胞之去活化……………… 33. 抗小鼠CD3 抗體(2C11)的靜脈注射在活體誘發T 細胞之去活化………………………………………………………………... 34、 [ΔCAM]DAPK 轉殖基因則會抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發病…………………………………………………………... 35四章 討論…………………………………………………………… 37、 DAPK 參與T 細胞之活化……………………………………… 37、DAPK 與DRAK2 在T 細胞中功能的異同…………………… 38、 DAPK 對NF-κB 活化之調控…………………………………. 39、DAPK 影響NFAT1 及NFAT2 之活化…………………………. 41、 DAPK 與T 細胞去活化的關係………………………………… 42、 DAPK 對自體免疫疾病的調控………………………………… 2表…………………………………………………………………… 45考文獻……………………………………………………………… 85錄……………………………………………………………………103application/pdf3922263 bytesapplication/pdfen-UST細胞活化DAP-kinasehttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/181779/1/ntu-97-D91449002-1.pdf