蔣丙煌 博士臺灣大學：食品科技研究所王湘伶Wang, Hsing-LingHsing-LingWang2007-11-272018-06-292007-11-272018-06-292004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/56392本實驗乃以含豆科植物 (黑豆、黃耆) 為基質，利用5L發酵槽培養靈芝，探討發酵條件對發酵液成分之影響。並以細胞實驗對發酵液進行抗過敏功能評估。實驗結果顯示，含黑豆5%，黃耆2%以及2%葡萄糖之基質，於24℃，通氣量0.5 vvm，轉速50 rpm，培養靈芝11天，可得最高產量之粗三萜類物質 (31.82 mg/g D.W.)。至於 (1→3)-β-D-glucan之生成量，發酵溫度的影響較通氣量來的明顯，而在18℃，0.75 vvm下可得最高產量。在發酵期間異黃酮素之醣基會被酵素 (β-glucosidase) 水解去除，而通氣量於0.75 vvm與0.25 vvm時，發酵至第五天可得Aglycone最高量。發酵液中胜肽濃度會隨著發酵時間的延長而有增加的趨勢，而總酚類化合物於發酵期間先升後降。 於抗過敏反應方面，靈芝發酵產品可以抑制人類週邊血液單核細胞 (HPBMNCs) 及鼠科胸腺癌細胞 (EL4 cell) 分泌TH1與TH2細胞激素 (IFN-γ、IL-2和IL-4)，因而具有減輕過敏反應之功能。其中，又以在24℃，通氣量0.5 vvm與0.75 vvm條件下所產生之發酵產品最具有發展成抗過敏保健食品之潛力。The objective of this research was to study the fermentation conditions for submerged cultivation of G. lucidum in a 5L fermenter using the medium containing leguminous plants. After the fermentation conditions were established the anti-allergic effects of the fermented products were investigated using cell culture systems. It was found that cultivation of G. lucidum in the medium consisting of 5% black soybean, 2% Astragalus membranaceus (Huangqi), and 2% glucose at 24℃, agitation speed 50 rpm, and aeration rate 0.5 vvm, yielded the highest crude triterpenes (31.82 mg/g D.W.). However, the fermentation conducted at 0.75 vvm and 18℃ yielded the highest amount of (1→3)-β-D-glucan. The maximum amount of aglycone was obtained on Day 5 during fermentation at an aeration rate 0.25 vvm and 0.75 vvm. The peptides contents increased during fermentation with time, and the content of total polyphenols reached a maximum value on Day 5, and decreased thereafter. For the anti-allergic effect, the mononuclear cells (MNCs) from human and EL4 cell from mouse were used. Results indicated that the fermented products could reduce the secretion of TH1/TH2-type cytokine (IFN-γ、IL-2、IL-4) by the mitogen-activated MNCs and EL4 cells. And the fermented products obtained at 24℃ and aeration rates of 0.5 vvm and 0.75 vvm had the potential to become a health-promoting food ingredients with anti-allergic function.頁碼 中文摘要---------------------------------------------- ii 英文摘要---------------------------------------------- iii 壹、 文獻回顧------------------------------------- 1 一、 靈芝之簡介----------------------------------- 1 (一) 靈芝之分類------------------------------------- 2 (二) 靈芝之化學成份 (1) 多醣類------------------------------------------ 4 (2) 活性多醣 (1→3)–β–D–glucan--------------------- 5 (3) 三萜類物質--------------------------------- 7 (4) 有機鍺---------------------------------------- 7 (5) 蛋白質-------------------------------------------- 8 (三) 靈芝的栽培方式 (1) 野生靈芝--------------------------------------- 8 (2) 栽培靈芝------------------------------------------ 8 (四) 深層液態醱酵 (1) 培養基成份---------------------------------------- 9 (2) 培養條件-------------------------------------- 12 二、 基質簡介 (一) 黑豆--------------------------------------------- 15 (二) 黃耆--------------------------------------------- 18 三、靈芝之抗過敏作用---------------------------------- 20 四、過敏反應 (一) 過敏反應之簡介----------------------------- 23 (二) 免疫與過敏-------------------------------------- 24 (三) TH1及TH2細胞激素的免疫功能----------------------- 26 (四) EL4細胞株-------------------------------------- 29 貳、研究目的與架構------------------------------------ 30 一、以豆科植物為基質之靈芝醱酵條件之實驗架構--------- 31 二、以細胞模式探討靈芝醱酵產物對過敏反應之影響----- 32 參、材料方法 第一部分：Ganoderma lucidum醱酵 一、實驗材料------------------------------------------ 33 (一) 菌株來源----------------------------------------- 33 (二) 藥品--------------------------------------------- 33 (三) 儀器--------------------------------------------- 35 二、實驗方法 (一) 菌株的培養-------------------------------------- 35 (二) 三角瓶培養 (二次活化) ----------------------- 36 (三) 接菌量------------------------------------------- 37 (四) 醱酵--------------------------------------------- 37 (五) 培養基成份--------------------------------------- 37 (六) 分析方法----------------------------------------- 38 (1)菌絲體濃度-------------------------------------- 38 (2)還原糖--------------------------------------------- 39 (3) (1→3)-β-D-glucan--------------------------------- 39 (4)總多醣--------------------------------------------- 40 (5)菌絲球直徑----------------------------------------- 40 (6)粗三萜--------------------------------------------- 40 (7)異黃酮素------------------------------------------ 40 (8)總酚類化合物------------------------------------ 43 (9)胜肽濃度測定--------------------------------------- 43 第二部分：以細胞模式探討靈芝醱酵產物對過敏反應之影響 一、實驗材料 (一) 細胞來源----------------------------------------- 44 (二) 血液來源----------------------------------------- 44 (三) 樣品--------------------------------------------- 44 (四) 藥品--------------------------------------------- 44 (五) 器材--------------------------------------------- 45 (六) 儀器--------------------------------------------- 46 二、實驗方法 (一) 人類免疫細胞之刺激 (1) 人類週邊血球細胞分離----------------------------- 46 (2) 赤芝醱酵液對人類週邊血球細胞增生測定方法--------- 47 (3) 人類週邊血液單核細胞之活化------------------------ 47 (4) 細胞激素表現量測定----------------------------- 48 (二) EL4之刺激 (1)赤芝醱酵液對人類週邊血球細胞增生測定方法----------- 49 (2) EL4 cell line之活化----------------------------------49 (3) 細胞激素表現量測定-------------------------------- 49 肆、結果與討論 第一部分：以豆科植物為基質之靈芝醱酵條件之探討 一、培養基之探討-----------------------------------------50 二、醱酵溫度之探討---------------------------------------53 三、通氣量之探討----------------------------------------57 (一)不同通氣量對於靈芝生長情形之影響--------------------57 (二) 醱酵期間靈芝菌體對基質活性成分之影響------------- 63 A. 醱酵期間異黃酮類化合物之變化情形---------------------63 B. 靈芝醱酵液總酚類化合物及胜肽隨著醱酵時間的變化情形----64 (三)不同通氣量對於靈芝醱酵過程總多醣與(1→3)–β–D–glucan生成量之影響-------------------------------- 67 (四)不同通氣量對粗三萜含量之影響---------------------- 69 第二部分：以細胞模式探討靈芝醱酵產物對過敏反應之影響 70 (一)靈芝醱酵樣品對人類週邊血液單核細胞 (HPBMNCs)及鼠科胸腺癌細胞 (EL4 cell)生長能力之影響-------- 73 (二)靈芝醱酵樣品對人類週邊血液單核細胞 (HPBMNCs)分泌細胞激素之影響---------------------------------------- 79 (三)靈芝醱酵樣品對鼠科胸腺癌細胞 (EL4 cell)分泌細胞激素之影響---------------------------------------------------- 90 伍、結論-----------------------------------------------101 陸、參考文獻-------------------------------------------103 圖次 圖一、(1→3)-β-D-glucan結晶結構-------------------------5 圖二、GLB7拮抗PMA對小鼠巨噬細胞內活性氧自由基的升高作用20 圖三、四種經由免疫機制產生之過敏反應---------------------23 圖四、IgE產生之調控--------------------------------------25 圖五、黃耆 (2%) 添加於6% 黑豆與2% Glucose中之結塊的現象--52 圖六、當黑豆與黃耆比例於5:2之組合下Medium呈均勻懸浮狀態--52 圖七、靈芝於不同溫度醱酵過程中總多醣與(1→3)-β-D-glucan之生成量-----------------------------------------------------54 圖八、不同溫度下β-1,3-D-glucan、總多醣與粗三帖含量變化關係----------------------------------------------------------56 圖九、不同通氣量對於靈芝醱酵過程中pH值之變化情形---------59 圖十、不同通氣量對於靈芝醱酵過程中菌絲球粒徑之變化情形---60 圖十一、不同通氣量對於靈芝醱酵過程中菌絲體濃度之變化情形-61 圖十二、不同通氣量對於靈芝醱酵過程中還原糖含量之變化情形-62 圖十三、醱酵期間異黃酮類化合物之變化情形-----------------65 圖十四、醱酵期間胜肽濃度之變化情形-----------------------66 圖十五、醱酵期間總酚類化合物之變化情形-------------------66 圖十六、不同通氣量對於靈芝醱酵過程中指標性成分(1→3)-β-D-glucan生成量之關係------------------------------------ 68 圖十七、不同通氣量對於靈芝醱酵過程中指標性成分總多醣生成量之關係---------------------------------------------------68 圖十八、不同醱酵條件之靈芝醱酵樣品對經p+I活化後之人類周邊血液單核細胞 (HPBMNCs) 細胞激素IFN-γ分泌的影響------------82 圖十九、不同醱酵條件之靈芝醱酵樣品對經p+I活化後之人類周邊血液單核細胞 (HPBMNCs) 細胞激素IL-2分泌的影響-------------83 圖二十、 不同醱酵條件之靈芝醱酵樣品對經p+I活化後之人類周邊血液單核細胞 (HPBMNCs) 細胞激素IL-4分泌的影響-----------84 圖二十一、不同醱酵條件之靈芝醱酵樣品對經p+I活化後之人類周邊血液單核細胞 (HPBMNCs) 細胞激素IL-13分泌的影響----------85 圖二十二、人類周邊血液單核細胞 (HPBMNCs) 經P+I活化24小時後，在添加不同醱酵條件之靈芝醱酵液對於細胞激素IFN-γ分泌的影響------------------------------------------------------86 圖二十三、人類周邊血球細胞 (HPBMNCs)經P+I活化24小時後，再添加於不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對於細胞激素IL-2分泌的影響------------------------------------------------------87 圖二十四、人類周邊血液單核細胞 (HPBMNCs) 經P+I活化24小時後，再添加於不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對於細胞激素IL-4分泌的影響----------------------------------------------88 圖二十五、人類周邊血液單核細胞 (HPBMNCs) 經P+I活化24小時後，再添加於不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對於細胞激素IL-13分泌的影響--------------------------------------------89 圖二十六、不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對經p+I活化後之鼠科胸腺癌細胞(EL4) 細胞激素IFN-γ分泌的影響------------- 93 圖二十七、不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對經p+I活化後之鼠科胸腺癌細胞(EL4) 細胞激素IL-2分泌的影響---------------- 94 圖二十八、不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對經p+I活化後之鼠科胸腺癌細胞(EL4) 細胞激素IL-4分泌的影響---------------- 95 圖二十九、不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對經p+I活化後之鼠科胸腺癌細胞(EL4) 細胞激素IL-13分泌的影響--------------- 96 圖三十、 鼠科胸腺癌細胞 (EL4) 經P+I活化24小時後再添加不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對細胞激素IFN-γ分泌的影響-------97 圖三十一、鼠科胸腺癌細胞 (EL4) 經P+I活化24小時後再添加不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對細胞激素IL-2分泌的影響-------98 圖三十二、鼠科胸腺癌細胞 (EL4) 經P+I活化24小時後再添加不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對細胞激素IL-4分泌的影響-------99 圖三十三、鼠科胸腺癌細胞 (EL4) 經P+I活化24小時後再添加不同醱酵條件生產之靈芝醱酵樣品對細胞激素IL-13分泌的影響-----100 表次 表一、相傳中靈芝的藥效-----------------------------------3 表二、分離自赤芝子實體之靈芝酸對肥大細胞釋放組織胺之影響-21 表三、LZ-8對小鼠產生全身性過敏反應之影響-----------------22 表四、CD4+輔助型T 細胞之. TH1及TH2細胞之特性-------------26 表五、大豆異黃酮標準品之分子量與HPLC檢測最大吸收波長-----42 表六、不同通氣量下培養靈芝11天時粗三萜之含量-------------69 表七、不同醱酵條件生產之靈芝醱酵液其活性成分分析結果-----71 表八、不同醱酵條件之靈芝醱酵濾液對人類週邊血液單核細胞 (HPBMNC) 增生能力之影響----------------------------------75 表九、不同醱酵條件之靈芝菌絲體水萃液對人類週邊血液單核細胞 (HPBMNC) 增生能力之影響----------------------------------76 表十、不同醱酵條件之靈芝醱酵濾液對EL4細胞增生能力之影響--77 表十一、不同醱酵條件之靈芝菌絲體水萃濾液對EL4細胞增生能力之影響----------------------------------------------------78 附錄 附錄一、5% 黑豆水萃液與2%黃耆水萃液之多醣與(1→3)-β-D-glucan含量----------------------------------------------118979525 bytesapplication/pdfen-US人類週邊血液單核細胞抗過敏反應(1→3)-β-D-glucan異黃酮粗三萜靈芝鼠科胸腺癌細胞TH1/TH2細胞激素黑豆黃耆Black soybeanHPBMNCsAglyconeAstragalus membranaceus (Huangqi)Ganoderma lucidumTH1/TH2-type cytokineAnti-allergicEL4 cellCrude triterpenes[SDGs]SDG3thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/56392/1/ntu-93-R91641021-1.pdf