指導教授：李昆達臺灣大學：生化科技學系張惠芬Chang, Hui-FenHui-FenChang2014-11-262018-07-062014-11-262018-07-062014http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/261617本研究結果顯示 Paenibacillus macerans 以 500 mL Hinton 氏搖瓶培養的最佳溫度為 30℃，最佳誘導用培養基酸鹼值為 pH 7.0，而最佳誘導溫度為 45℃。所得的木聚醣酶，最好的酵素反應條件是 55℃ 與 pH 4.5。相對於葡萄糖、麥芽糖與木糖，於生長期間較適合的碳源是甘油。於酵素誘導期間，相對於誘導物蔗渣、黃豆粉、白楊木粉與山毛櫸木聚醣，麩皮具有最好的木聚醣酶酵素誘導能力。利用 Hinton 氏搖瓶培養 P. macerans，於 37℃ 培養 20 小時，添加 2% 麩皮誘導，同時升溫至 45℃，再繼續培養 34 小時後，酵素濃度為 15 IU/mL。以 5 公升發酵槽進行放大培養，於 37℃ 培養 9.5 小時，添加 2% 麩皮誘導，同時升溫至 45℃，再繼續培養 28 小時後，產生的酵素產量為 15 IU/mL，比搖瓶縮短了 16.5 小時的培養時間，便能得到相同的酵素濃度。將木聚醣酶搭配漆酶進行功能性試驗─利用紙漿進行生物漂白，能夠顯著地降低 3.7 單位卡巴值，並提升 ISO 白度 2%。利用糖苷水解酶 (glycoside hydrolase) 家族第 11 族的 4 個保守性序列 (conserved sequences) 與染色體步移技術 (genome-walking technique) 將來自耐熱細菌 P. macerans 的木聚醣酶基因調取出來，並選殖了 633 個核酸，此段序列對應到 211 個胺基酸殘基。當此段基因被轉殖並表現到大腸桿菌 Escherichia coli M15/pREP4 時，利用 anti-His taq 抗體偵測重組蛋白，發現重組菌株將表現出的木聚醣酶聚集到內涵體中，即使以 16℃、24 小時誘導，仍無法改善。將細菌以超音波震碎並離心後的上清液中，其所含的可溶性蛋白質，經過濃縮也測不出木聚醣酶活性。由 P. macerans 產生的木聚醣酶，同時具有熱穩定性與酸穩定性。可被應用在製漿造紙工業，進行生物漂白與從農、林、食品工業廢棄物來產生木寡醣 (xylooligosaccharides) 益生源。Our reports showed that when cultured in 500 mL Hinton’s flask, the optimum temperature for Paenibacillus macerans is 30℃, the optimum pH of induction medium is pH 7.0, and the optimum induction temperature is 45℃. The xylanase of P. macerans was optimally active at 55℃ and pH 4.5. Compared with glucose, maltose, and xylose, the most suitable carbon source in growth stage was glycerol. Compared with bagasse, soya powder, white poplar powder, and beechwood xylan, the best carbon source we investigated to induce xylanase activity was wheat bran. While grown for 20 hours at 37℃, we added wheat bran to start induction phase, and rising temperature to 45℃ at the same time, continuing to culture for 34 hours, having the xylanase with the concentration of 15 IU/mL. To scale up, we cultured P. macerans in the 5 L bioreactor. While grown for 9.5 hours at 37℃, we added wheat bran, and rising temperature to 45℃, continuing to culture for 28 hours, having the xylanase activity with 15 IU/mL. Compared with flask culture, we could obtain the same amount of xylanase with shortened incubation time of 16.5 hours. Coordinated with laccase, we carried out functional assay─the bio-bleaching of pulp. The xylanase significantly reduced kappa number by 3.7 units, and increased the ISO brightness by 2%. We used 4 conserved sequences of glycoside hydrolase family 11 (GH11) and genome-walking technique to acquire xylanase nucleotide sequence in moderately thermophilic bacterium P. macerans. A xylanase gene of 633 bp was cloned that encodes a protein containing 211 amino acid residues. When the xylanase gene was cloned and expressed in Escherichia coli M15/pREP4, we used anti-His taq antibody to detect the recombinant protein, figuring out the recombinant strain produced almost all the xylanase in the inclusion body, even after long-time induction at low temperature. The soluble protein in the supernatant after sonication showed low xylanase activity, even concentrated. The xylanase of P. macerans is one of the rare xylanases that exhibits thermo- and acid stability, and thus, it is a suitable candidate for pre-bleaching of paper pulps and generating xylooligosaccharides from agro-residues for use as prebiotics.口試委員審定書 i 中文摘要 ii Abstract iii 縮寫表 v 專有名詞 中英文對照表 vi 目錄 vii 圖表目錄 xiii 第一章 前言 1 1.1 Paenibacillus macerans 2 1.2 木聚醣 2 1.2.1 木聚醣 2 1.2.2 木聚醣降解系統 4 1.3木聚醣酶 4 1.3.1 木聚醣酶之分類 4 1.3.2 第 10 族與第 11 族之比較 6 1.3.3 內切型木聚醣酶特性 6 1.3.4 木聚醣酶之應用 7 1.3.4.1 生物漂白的重要性 9 1.3.5 被選用木聚醣酶之考慮因素-耐熱性 10 1.3.6 木聚醣酶之來源及其生產 11 1.3.7 木聚醣酶之異源表達 13 1.4 研究動機與目的 14 1.5 研究大綱 15 第二章 材料與方法 17 2.1微生物與載體 18 2.1.1 菌株來源 18 2.1.2 調節表現的質體 pREP4 18 2.1.3 pQE-30 Xa 19 2.1.4 pCR-Blunt 19 2.2 P. macerans之培養基酵素活性 20 2.3 P. macerans之搖瓶培養 21 2.4 P. macerans之發酵槽培養 21 2.5 含有木聚醣酶之培養液後處理 22 2.5.1 超過濾法 (ultrafiltration) 22 2.5.2 Bradford 蛋白質定量法 (Bradford assay) 23 2.5.3 非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳 (native-PAGE) 23 2.6 Zymogram分析 23 2.7 木聚醣酶活性測定 24 2.8 木聚醣酶之功能性試驗 25 2.8.1 紙漿之含水率測定 25 2.8.2 酵素漂白試驗 25 2.8.3 紙漿卡巴值試驗 26 2.8.4 白度測試用之手抄紙製備 27 2.8.5 紙張白度測試 28 2.9 P. macerans之木聚醣酶基因調取 29 2.9.1 BLAST序列比對 29 2.9.2 NCBI資料庫 29 2.9.3 木聚醣酶家族中的保守性序列 30 2.9.4 染色體步移技術 (genome walking technique) 31 2.9.4.1 限制酶酶切反應 32 2.9.4.2 接合酶 (ligase) 反應 32 2.9.4.3 遞減聚合酶連鎖反應 (touchdown PCR) 33 2.10 聚合酶連鎖反應 36 2.10.1 細菌基因組DNA 之抽取 36 2.10.2 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 37 2.11 質體之建構 38 2.11.1 挖膠純化與限制酶反應 38 2.11.2 質體之抽取 39 2.11.3 線性質體之製備 39 2.11.4 接合酶 (ligase) 反應 40 2.12 大腸桿菌之轉形 41 2.12.1 勝任細胞 (competent cell) 製作 41 2.12.2 轉形 41 2.12.3 以 PCR 確認轉形株 42 2.13 大腸桿菌之異源表現與破菌 43 2.14內涵體之純化 43 2.14.1製備內涵體 43 2.14.2內涵體蛋白質之失活 44 2.15 SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 44 2.16 CBB染色 45 2.17 西方墨點轉漬法 45 2.18 統計分析方法 45 第三章 結果 47 3.1 P. macerans 之培養基酵素活性 48 3.2 木聚醣酶活性測試之反應條件最適化 48 3.3 P. macerans 之搖瓶生產條件最適化 48 3.3.1 誘導期溫度、pH值與添加誘導物與否之條件最適化 48 3.3.2 生長之最適溫度 49 3.3.3 培養基組成分最適化 49 3.3.4 酵素誘導物之最適化 50 3.3.5 麩皮誘導條件最適化 50 3.4 P. macerans之發酵槽培養 51 3.5 Zymogram 活性染色與 CBB 染色結果 51 3.6 P. macerans 之木聚醣酶功能性測試 52 3.7 P. macerans 木聚醣酶基因之選殖 52 3.7.1 調取木聚醣酶基因 52 3.7.2 序列比對結果 53 3.8 E. coli 之木聚醣酶轉形株建立 54 3.8.1 表現載體 pQE-30 Xa-xylanase 之建構 54 3.8.2 木聚醣酶轉形株確認 54 3.9 E. coli 表現異源蛋白質之結果 55 3.9.1 胞內可溶性蛋白質之木聚醣酶活性確認 55 3.9.2 內涵體中蛋白質之西方墨點轉漬法結果 55 3.9.3 不同誘導溫度之比較 55 第四章 討論與結論 57 4.1 討論 58 4.1.1 木聚醣酶體 (xylanosome) 58 4.1.2 細菌生長期與誘導期之溫度 59 4.1.3 未能成功進行外源表現之可能性 60 4.1.4 未來展望 61 4.2 結論 61 圖表 63 參考文獻 85 附錄 951581987 bytesapplication/pdf論文使用權限：不同意授權類芽孢桿菌山毛櫸木聚醣麩皮木聚醣酶染色體步移技術thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/261617/1/ntu-103-R01b22025-1.pdf