劉聰桂臺灣大學：地質科學研究所陳郁挺Chen, Yu-TingYu-TingChen2007-11-262018-06-282007-11-262018-06-282005http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/54799台灣西南沿海地區的布袋與北門、學甲與義竹等鄉鎮曾同為地方性烏腳病疫區。以往研究證實該病是因為飲用當地含高濃度砷與腐植物質之地下水而引起。前人對此區沈積物中與砷還原作用相關的地質微生物研究尚缺。硫酸根還原菌在厭氧環境中對許多生物化學作用有極大影響，而硫酸根還原菌Desulfovibrio spp.與Desulfomicrobium spp.等對砷及腐植酸亦都有還原能力。 本研究利用布袋鑽井岩芯，分析其孔隙水及沈積物，以瞭解細菌存在的地化背景如有機碳含量、腐殖物質與離子濃度等。利用分子生物的技術萃取沈積物中細菌的DNA，對硫酸根還原菌之16S rRNA基因進行聚合酶鏈合反應(PCR)，分析與砷或腐殖物質有關的硫酸根還原菌屬，探討此鑽井地層硫酸根還原菌的種類與分佈。 分析結果顯示，從深度20至248公尺間所採集之岩芯沈積物中應皆有硫酸根還原菌之存在，應與地層含有濃度較高的硫酸根與有機物，且泥、砂互層頻繁，利於硫酸根還原菌存在有關。Desulfovibrio spp.與Desulfomicrobium spp.普遍存在布袋岩芯孔隙水砷與腐殖物質濃度高的層位。而有能力代謝砷之硫酸根還原菌Desulfotomaculum存在於高腐殖物質濃度之處以及部分高砷濃度的層位。此外，有還原腐殖酸能力的硫酸根還原菌Desulfobulbus propionicus存在於深80公尺處之地層。The village Putai was one of the four main “blackfoot disease”(BFD) endemic area located on the southwest coast of Taiwan. There have been many studies on accumulation and release of arsenic in sediments in these areas, but geomicrobiologic study is scarce. Sulfate-reducing bacteria contribute a diverse group of prokaryotes that contribute a variety of essential functions in many anaerobic environments. Recently, many studies suggest that sulfate reducers such as Desulfovibrio spp. and Desulfomicrobium spp. might be responsible for arsenate reduction in sediments, and certain sulfate-reducing bacteria might be able to reduce humic substances. This study aims at revealing the geochemical characteristics of sediments and porewater from a core drilling at Putai. Using molecular biological method, DNA was extracted from sediments. PCR primer sets for the 16S rRNA gene of specific sulfate-reducing bacteria were designed to identify principal sulfate-reducing bacteria related to the reduction of arsenic and humic substances, in sediments with higher concentration of arsenic and humic substances. The results show that all sediment samples between 20 and 248 m depth have demonstrated the presence of sulfate-reducing bacteria. High concentrations of sulfate and organic matter within the frequent intercalation of clay, silt and fine-grained sand layers favorite growth conditions of sulfate-reducing bacteria. Desulfovibrio and Desulfomicrobium seem to be commons in the layers which have high concentration of arsenic and humic substances. Desulfotomaculum had been found mostly in layers of high humic substances and in some l high arsenic layers. Humic – reducing bacteria such as Desulfobulbus propionicus have also been found at 80m depth.目 錄 摘要………………………………………………………………… I Abstract……………………………………………………………… II 目錄…………………………………………………………………… III 圖目錄………………………………………………………………… VI 表目錄………………………………………………………………… VII 第一章 緒論……………………………………………………… 1 1-1研究動機與目的………………………………………… 1 1-2研究區域概述…………………………………………… 2 1-2-1地理位置…………………………………………… 2 1-2-2地質概述…………………………………………… 3 1-2-3水文地質概述……………………………………… 4 1-2-4地下水之地球化學特性…………………………… 5 1-3 文獻回顧………………………………………………… 7 1-3-1國內外相關研究…………………………………… 7 1-3-2砷的來源、分佈與毒性…………………………… 9 1-3-3砷在沈積物—水間之遷移………………………… 10 1-3-4砷與硫酸還原菌…………………………………… 13 1-3-5腐殖物質特性……………………………………… 16 1-3-6腐殖物質與硫酸還原菌…………………………… 18 1-4硫酸還原菌……………………………………………… 19 第二章 材料與方法……………………………………………… 24 2-1採樣地點………………………………………………… 24 2-2採樣方法………………………………………………… 25 2-3布袋鑽井岩芯概述……………………………………… 27 2-4硫酸還原菌（SRB）培養基………………………………… 30 2-5 PCR之引子(Primer)…………………………………… 33 2-6樣品前處理……………………………………………… 33 2-6-1岩芯孔隙水………………………………………… 33 2-6-2沈積物總有機探分析前處理……………………… 34 2-7孔隙水分析……………………………………………… 34 2-7-1 陰離子分析………………………………………… 34 2-7-2陽離子分析………………………………………… 34 2-7-3螢光強度分析……………………………………… 34 2-8沈積物總碳及總有機碳分析…………………………… 35 2-9沈積物微生物分析……………………………………… 36 2-9-1硫酸還原菌增菌培養……………………………… 36 2-9-2培養瓶中硫化氫分析……………………………… 36 2-9-3沈積物中細菌總DNA萃取………………………… 38 2-9-4 16S rRNA基因聚合酶鏈合反應…………………… 40 2-9-5膠體電泳分析……………………………………… 41 2-10分析之品管與品保……………………………………… 43 第三章 結果與討論……………………………………………… 45 3-1孔隙水水質分析結果…………………………………… 45 3-1-1基本水質與主要離子濃度變化…………………… 45 3-1-2陰離子分析結果與討論…………………………… 46 3-1-3螢光強度分析結果與討論………………………… 47 3-1-4孔隙水之砷、鐵與錳濃度變化…………………… 48 3-2布袋鑽井岩芯沈積物之碳含量………………………… 49 3-3硫酸還原菌的分佈……………………………………… 64 3-3硫酸還原菌的種類……………………………………… 65 第四章 結論……………………………………………………… 72 參考文獻…………………………………………………………… 73 中文部分…………………………………………………………… 73 英文部分…………………………………………………………… 76 圖 目 錄 圖1-1採樣地點(布袋)位置圖………………………………………… 2 圖1-2當pH=7時的還原序列………………………………………… 6 圖1-3不同pH值下(A)砷酸鹽與(B)亞砷酸鹽之物種的含量百分比 13 圖1-4具有砷代謝能力原核生物之親緣演化多樣性………………… 15 圖1-5硫酸還原菌可影響之化學反應………………………………… 20 圖2-1岩芯沈積物微生物分析流程圖………………………………… 24 圖2-2布袋鑽井地層柱狀圖及沈積環境……………………………… 26 圖2-3包含6組主要硫酸還原菌屬之親源分類……………………… 31 圖2-4硫化氫濃度校正曲線…………………………………………… 37 圖3-1 布袋鑽井岩芯孔隙水電導度、pH、主要陽離子、鐵、錳、砷及腐殖物質濃度隨深度變化圖……………………………… 52 圖3-2 布袋鑽井岩芯孔隙水鹼度、主要陰離子濃度及岩芯沈積物總有機碳含量隨深度變化圖…………………………………… 53 圖3-3 硫酸還原菌GI、Ｇ2 PCR結果及對照組……………………… 59 圖3-4 硫酸還原菌G3、Ｇ4 PCR結果及對照組……………………… 60 圖3-5 硫酸還原菌G5、Ｇ6 PCR結果及對照組……………………… 61 圖3-6 硫酸還原菌DSV、DSM PCR結果及對照組……………………… 62 圖3-7硫酸還原菌DSN 及16S rRNA PCR結果……………………… 63 圖3-8產物硫化氫濃度與深度對照圖………………………………… 69 表 目 錄 表2-1硫酸還原菌培養基(Widdel’s medium)…………………… 27 表2-2 Trace element mixture…………………………………… 28 表2-3 Components of vitamin solution………………………… 28 表2-4 Selenite solution………………………………………… 28 表2-5 NaHCO3 solution…………………………………………… 29 表2-6 Sulfide solution ………………………………………… 29 表2-7 純種硫酸還原菌培養基成分( DSMZ medium63)………… 29 表2-8 PCR 之引子序列…………………………………………… 32 表2-9 PCR 反應試劑……………………………………………… 40 表2-10 PCR 反應條件…………………………………………… 41 表3-1布袋鑽井岩芯孔隙水主要陰、陽離子平衡檢驗表………… 51 表3-2布袋岩芯孔隙水之砷、鐵與錳之濃度及螢光強度………… 54 表3-3布袋岩芯孔隙水基本水質與主要離子濃度………………… 55 表3-4布袋岩芯沈積物之碳含量…………………………………… 58 表3-5硫酸還原菌生長記錄表……………………………………… 68 表3-6 PCR結果(布袋岩芯沈積物硫酸還原菌屬分佈)…………… 70 表3-7 SRB分類對照孔隙水分析相關資料………………………… 712529188 bytesapplication/pdfen-US硫酸根還原菌腐殖物質砷沈積物rearsenicSulfate-reducing bacteriasedimentshumic substancesthesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/54799/1/ntu-94-R90224214-1.pdf