陳炳煇臺灣大學：機械工程學研究所吳孟勳Wu, Meng-HsunMeng-HsunWu2007-11-282018-06-282007-11-282018-06-282004http://ntur.lib.ntu.edu.tw//handle/246246/61346本論文主要是設計一種新式的複式即時定量聚合酶連鎖反應檢測儀器，儀器內獨特設計之光學檢測系統是以全波段氙氣燈為激發光源，以高感度光譜儀為螢光擷取系統，搭配準確控制的溫控系統，完成複式即時定量聚合酶連鎖反應(Multiplexing Real-Time PCR)。相較於一般市售的Real-Time PCR機器使用離散式螢光檢測，本論文中設計之螢光擷取並使用連續式波段螢光檢測系統，可同時檢測5個通道以上的樣本。實驗結果顯示，在進行複式即時定量聚合酶連鎖反應時可同時檢測到試劑中多種不同螢光，且以本論文設計之系統實驗結果將與商用機型的實驗結果比較，有較好之DNA增生結果。本系統之PCR實驗結果由標準曲線圖（Standard Curve）可以看出本系統在PCR實驗時，隨著不同的起始濃度在PCR增生後所得到之Cp值呈現線性的關係，因此在不同的起始濃度下PCR都有很穩定的增生效率，當起始濃度每增加10倍時，PCR反應之Cp值減少約3.9，經過計算本系統PCR反應時每次的溫度循環增生效率約為1.8倍。本系統之PCR實驗結果由變異係數（CV值）的比較可以看出本系統在PCR實驗中有良好的重現性（Reproducibility），論文中將與商用機型詳細比較。This study sets up a prototype of Multiplexing Real-Time polymerase chain reaction (PCR) machine that employs a xenon light source for exciting fluorescence and a miniature spectrometer for detecting the emission fluorescence intensity from Real-Time PCR mix in a ml volume glass capillary. Compared with the traditional Real-Time PCR machine with discrete channels fluorescence wavelength detection, the prototype can provide continuous wavelength detection and can be employed for multiplex DNA quantification. To compare the DNA quantification accuracy and reproducibility of the present system with those of the commercial system, we use a HBV DNA template with LC-Red 640 dye and an Internal Control template with LC-Red 705 dye in this study. The results of this experiment reveal that the Real-Time PCR prototype yields more amplification quantity than the commercial system. As the initial copies of template DNA increase every ten times, Cp decreases by a value of 3.9. Therefore, the number of template DNA increases by 1.8 times each thermal cycle. The results also reveal that this prototype has the same accuracy for DNA quantification and the reproducibility within five intra assay samples as the commercial system.中文摘要 i 英文摘要 ii 目錄 iii 附表目錄 v 附圖目錄 vi 符號說明 ix 第一章 緒論 1 1.1 前言 2 1.2 文獻回顧 3 1.3 論文架構 7 第二章 研究方法與原理 8 2.1 複式即時定量聚合酶連鎖反應 8 2.1.1 歷史與發展背景 9 2.1.2 Real-Time PCR基本原理 10 2.1.3 影響複式即時定量聚合酶連鎖反應的因素 11 2.1.4 應用與其優缺點 15 2.2 複式即時定量聚合酶連鎖反應光學檢測系統 15 2.2.1 離散式螢光波段光學檢測系統設計 16 2.2.2 連續式螢光波段光學檢測系統設計 16 2.3 複式即時定量聚合酶連鎖反應螢光訊號數值模型 17 2.3.1. 螢光訊號數值模型 17 2.3.2. 離散式螢光訊號數值模型 18 2.3.3. 數值模型驗證 20 2.3.4. 連續式螢光訊號數值模型 20 2.3.5 離散式螢光檢測系統之訊號處理 21 2.3.6. 連續式螢光檢測系統之訊號處理 22 2.4 溫度循環控制–三模式控制 23 第三章 研究設備與實驗步驟 25 3.1 實驗試劑與化學藥品 25 3.1.1 複式即時定量聚合酶連鎖反應實驗 25 3.2 研究設備 28 3.2.1激發光源與光譜儀(Spectrometer) 28 3.2.2 溫度循環與控制系統 29 3.2.3 測試載具 31 3.2.4 商用Real-Time PCR Machine 32 3.2.5 平板凝膠電泳偵測系統 32 3.3 實驗步驟 33 第四章 實驗結果與討論 36 4.1 溫度循環控制系統之測試 36 4.2 聚合酶連鎖反應（PCR Reaction）之結果 37 4.3 即時定量聚合酶連鎖反應（Real-Time PCR）之螢光訊號 38 4.4 複式即時定量聚合酶連鎖反應（Multiplexing Real-Time PCR）之螢光訊號 41 4.5 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統之重現性與精確度 45 第五章 結論與未來展望 46 5.1 結論 46 5.2 新型複式即時定量聚合酶連鎖反應系統開發之未來展望 48 參考文獻 50 附表目錄 表3.1 OceanOptics PX-2氙氣燈規格表 54 表3.2 OceanOptics USB2000 Fiber Optic Spectrometer規格表 55 表4.1 聚合酶連鎖反應各項溫度時間設定圖 56 表4.2 聚合酶連鎖反應各項試劑濃度與用量 57 表4.3 複式即時定量聚合酶連鎖反應各項試劑濃度與用量 58 表4.4 複式即時定量聚合酶連鎖反應各項試劑濃度與用量 59 表4.5 複式即時定量聚合酶連鎖反應各項試劑濃度與用量 60 表4.6 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統重現性分析 61 附圖目錄 圖2.1.1 聚合酵素連鎖反應之 DNA 複製原理 62 圖2.1.2 聚合酵素連鎖反應之 DNA 複製過程 63 圖2.1.3 傳統DNA定序螢光標記結果判讀 64 圖2.1.4 Hybridization Probes螢光發光機制 65 圖2.2.1 一般市售Real-Time PCR Machine之離散式螢光波段光學檢測系統設計圖 66 圖2.2.2 複式即時定量聚合酶連鎖反應光學檢測系統示意圖 67 圖2.3.1 離散式螢光波段之光路設計 68 圖2.3.2 光透過DNA樣本與裝載此樣本之毛細管的散射情形 69 圖2.3.3 參數S對樣品長度x之關係圖 70 圖2.3.4 模擬離散式光學檢測系統檢測複製出之DNA所發出螢光強度對溫度循環數關係圖 71 圖2.3.5 連續式螢光波段檢測裝置與其計算之積分範圍示意圖 72 圖2.3.6 模擬連續式光學檢測系統檢測複製出之DNA所發出螢光強度對溫度循環數關係圖 73 圖3.2.1 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統研究設備示意圖 74 圖3.2.2 複式即時定量聚合酶連鎖反應光學檢測系統示意圖 75 圖3.2.3 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統激發光源 76 圖3.2.4 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統濾鏡組 77 圖3.2.5 高感度光譜儀（Spectrometer） 78 圖3.2.6 高感度光譜儀即時監控軟體 79 圖3.2.7 溫度循環與控制系統示意圖 80 圖3.2.8 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統加溫裝置 81 圖3.2.9 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統風扇裝置 82 圖3.2.10 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統溫度擷取裝置 83 圖3.2.11 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統步進馬達 84 圖3.2.12 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統使用者設定介面 85 圖3.2.13 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統即時監測介面 86 圖3.2.14 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統控制主機板 87 圖3.2.15 Real-Time PCR 專用20μl玻璃毛細管 88 圖3.2.16 Real-Time PCR 專用玻璃毛細管Sample Carousel 89 圖3.2.17 商用Real-Time PCR Machine 90 圖3.2.18 平板凝膠電泳設備 91 圖3.2.19 平板凝膠電泳偵測系統 92 圖3.3.1 裝載玻璃毛細管於Carousel上 93 圖4.1.1 複式即時定量聚合酶連鎖反應系統溫度的紀錄圖 94 圖4.2.1 PCR 增生後之洋菜凝膠電泳分離檢測結果 95 圖4.2.2 PCR 增生後之洋菜凝膠電泳分離檢測結果比較 95 圖4.3.1 螢光波長在640nm附近之螢光變化光譜圖 96 圖4.3.2 本系統LC640螢光隨溫度循環次數變化情形CHBV=109 97 圖4.3.3 本系統LC640螢光隨溫度循環次數變化情形CHBV=108 98 圖4.3.4 本系統LC640螢光隨溫度循環次數變化情形CHBV=107 99 圖4.3.5 本系統LC640螢光隨溫度循環次數變化情形CHBV=106 100 圖4.3.6 本系統LC640螢光隨溫度循環次數變化情形CHBV=105 101 圖4.3.7 本系統LC640螢光隨溫度循環次數變化情形CHBV=104 102 圖4.3.8 本系統LC640螢光隨溫度循環次數變化情形CHBV=0 103 圖4.3.9 商用Real-Time PCR Machine螢光增加值 104 圖4.3.10 本系統量測之Cp值與起始濃度標準曲線 105 圖4.3.11 商用機型量測之Cp值與起始濃度標準曲線 106 圖4.4.1 本系統Multiplexing Real-Time PCR螢光增加值與溫度循環次數關係圖 107 圖4.4.2 本系統Multiplexing Real-Time PCR以全頻帶光當激發光之螢光增加值與溫度循環次數關係圖 108 圖4.4.3 本系統Multiplexing Real-Time PCR之螢光增加值與溫度循環次數關係圖 109 圖4.4.4 本系統Multiplexing Real-Time PCR之螢光增加值與溫度循環次數關係圖 110 圖4.4.5 本系統Multiplexing Real-Time PCR之螢光增加值與溫度循環次數關係圖 1111489673 bytesapplication/pdfen-US全波段氙氣燈高感度光譜儀連續式波段螢光檢測系統連鎖反應複式即時定量聚合酶spectrometerxenon light sourcecontinuous wavelength fluorescence detection channMultiplexing Real-Time polymerase chain reaction (thesishttp://ntur.lib.ntu.edu.tw/bitstream/246246/61346/1/ntu-93-R91522305-1.pdf